遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变分析.docVIP

　　遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变分析 作者：李敏，王丽君，张彩娥，吴雄文，邓云华 【摘要】 目的： 通过对一遗传性对称性色素异常症家系的致病基因DSRAD进行检测，以期寻找到新的致病突变. 方法 ： 采用RTPCR方法从人外周血中获得DSRAD基因cDNA，然后克隆至pTA2 vector,经阳性克隆筛选后进行基因序列测定，通过BLAST程序网上比对找出可能突变位点，再采用单链构象多态性技术进行新突变验证. 结果： 对该家系DSRAD基因测序发现患者存在碱基替换A1167G(Q389Q)，由于编码的氨基酸未改变，均为谷氨酰胺，为一种同义突变. 经单链构象多态性 分析 证明该突变只存在于该家系患者，不存在于家系健康人和100名无亲缘关系对照者. 结论： 该同义突变可能导致患者皮肤色素异常改变，其具体的机制尚需进一步 研究 . 【关键词】 遗传性对称性色素异常症；突变；DSRAD基因；cDNA克隆；聚合酶链反应；多态现象，单链构象 0引言 遗传性对称性色素异常症(dyschromatosis symmetrical hereditaria, DSH)， 1924年首先由Toyama等在日本报道. 该病主要发生于日本和 中国 ，另外韩国、印度、欧洲和北美也有少量报道［1］. DSH多为常染色体显性遗传，具有较高的外显率，亦有散发患者和常染色体隐性遗传的报道［2］，其发病机制尚不清楚. 近年来，国内外多个研究小组对该症进行了系列遗传学研究，最终确定了其致病基因为双链RNA特异性腺苷脱氨酶(double stranded RNA specific adenosine deaminase, DSRAD)［3］. 到 目前 为止，在DSH患者中共发现40余种DSRAD基因的突变. 为完善该症的突变谱，我们对一个DSH家系的DSRAD基因进行了突变检测，研究DSRAD基因的突变位点在皮肤的色素代谢中可能起到的作用. 1对象和方法 1.1对象本研究中家系3代，共11人，其中6例患者（图1）. 先证者: 女,9岁，体格发育和智力与同龄人相仿, 未发现明显的系统症状. 3岁时出现手背散在色素减退斑，随着年龄增大，色素减退斑越来越明显，并夹杂色素沉着斑点，皮损缓慢蔓延，目前已侵及手腕部及右脚踝，皮损夏季明显而冬季减轻. 先证者的母亲(II2)自述3岁左右开始出现皮损，目前色素异常性皮损主要位于手足背，呈对称性分布，面部有少量雀斑样皮损. 先证者的舅舅(II1)及其儿子(III2)女儿（III3）有类似表型，于四肢末端陆续出现深浅不一的色素减退斑，间杂褐色斑片,其临床表现符合DSH. 所有患者黏膜、指(趾)甲、牙齿和毛发均正常. 图1DSH家系图 1.2方法 1.2.1遗传物质的获取获得知情同意后，无菌采集该家系成员静脉血5 mL，常规提取基因组DNA；同时还采集先症者与一名正常家系成员静脉血5 mL以提取mRNA. 100名对照（以排除可能存在的基因多态性）来自湖北及周边地区的正常人，未发现有色素异常. 1.2.2引物设计与合成根据GenBank中公布的人DSRAD基因的cDNA序列通过Primer5.0软件设计3对PCR特异性引物扩增该基因全长，由上海英骏生物技术有限公司合成. 引物序列如下：第1对：上游引物P1：5′ GGAGTAGCGGAGGCGTGG 3′，下游引物P2：5′ CTTGCTGGTTCTGGTCTGGC 3′；第2对：上游引物P1：5′ GTGGAGAATGGGCAGGAA 3′，下游引物P2：5′ AGCAAGGAGGGCTGGAAG 3′；第3对：上游引物P1：5′ TCTCACTGGCAGCACCTT 3′，下游引物P2：5′ CCATCTGTCACTGGAGCAT 3′. 扩增片段大小分别为1400, 1400和1290 bp. 　　依据比对分析结果，拟对突变部位进行单链构象多态性分析的引物序列为：上游引物P1: 5′ TTGACAGACAAGAAGCGAG 3′，下游引物P2: 5′ CTGCCCATTCTCCACTTT 3′. 其扩增产物长度是177 bp. 1.2.3RTRCR扩增DSRAD基因分离白细胞，用TrizoL一步法抽提基因组mRNA，按照逆转录试剂盒将总的mRNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系包4 μL 5×buffer(含Mg2+)， 2 μL dNTP，4 μL cDNA，上下游引物各1 μL，1.5 μL Tag酶，加双蒸水至20 μL. PCR反应条件为96℃预变性3 min, 然后96℃变性1 min,退火55℃ 60 s,延伸72℃ 2 min,共30个循环，最后72℃延伸10 min. PCR