银杏、川芎制剂与骨髓基质细胞联合治疗局灶性脑缺血的实验研究.docVIP

　　银杏、川芎制剂与骨髓基质细胞联合治疗局灶性脑缺血的实验研究 【摘要】 目的 探讨银杏、川芎制剂是否可以使骨髓基质细胞(MSCs) 治疗 局灶性脑缺血最佳时间窗延后。方法 SD大鼠随机分为对照组、MSCs组、MSCs+中药组，每组10只。采用线栓法制备大鼠缺血再灌注模型。MSCs 组尾静脉注入MSCs；MSCs +中药组静脉注入银杏、川芎制剂，48 h注入MSCs；对照组注入PBS。应用姿势反射实验和肢体不对称应用实验进行神经功能障碍评价，脑组织双免疫荧光组化检测。结果 MSCs 组、MSCs+中药组神经功能障碍程度明显好于对照组(P＜0.05)，两治疗组之间无显著差异(P＞0.05)。免疫组化显示，MSCs 组、MSCs+中药组在梗死灶部位BDNF及GFAP表达显著。结论 银杏、川芎制剂可使MSCs治疗时间窗延后，促进MSCs在脑病灶内分布、分化。 【关键词】 脑缺血；银杏；川芎；骨髓基质细胞 以往研究证实，骨髓基质细胞(MSCs)静脉移植治疗大鼠局灶性脑缺血疗效确实，可降低脑梗死体积，促进神经功能障碍的恢复〔1〕，静脉移植MSCs最佳时间窗是在缺血发生后3～24 h，临床在最佳时间窗内应用MSCs治疗局灶性脑缺血可达到理想效果。川芎活性成分川芎嗪和阿魏酸具有扩张血管，抑制血小板活性作用〔2〕，银杏活性成分为黄酮类和萜内脂类，具有扩张血管、增加脑血流、抗氧化、抗自由基等脑保护作用〔3〕。本研究采用复方中药银杏、川芎制剂联合MSCs治疗大鼠局灶性脑缺血，探讨银杏、川芎制剂是否可以使MSCs治疗最佳时间窗延后，是否能促进MSCs在脑病灶内分布、分化。 　 　1 材料与方法 　　1.1 动物 3月龄SpragueDag/ml)制成无菌液(长春长云生物制药股份有限公司)。BrdU(5溴脱氧尿核苷5Bromo2deoxyuridine)美国Sigma公司。BrdU〔Bromodeoxyuridine 溴代脱氧尿(嘧啶核)苷〕、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)及一抗，SABCFITC均购自武汉博士德生物工程公司(博士德公司分装)。 　　1.2.2 模型制备 参照Zea Longa法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。切开一侧颈部皮肤，手术显微镜下分离右颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉，接近颅底部位电灼后结扎切断颈外动脉，分离颈内动脉至鼓泡处，并暴露出翼腭动脉。在颈内动脉远端备线并放置动脉夹，在近心端距颈总动脉分叉0.5 cm处用7号注射器针穿刺颈总动脉，注入少许肝素钠盐水，插入40尼龙线23～25 mm，进入规定深度遇轻微阻力后停止，扎紧备线，栓线在皮肤外留有1 cm长线头，缝合皮肤。MCA阻断后2 h将栓线撤至颈总动脉，麻醉苏醒后大鼠左侧前肢体瘫、走路向一侧偏斜、右眼睑低垂为局灶性脑缺血再灌注制备成功模型。随机分为对照组、MSCs组、MSCs+中药组，每组10只。 　　1.2.3 给药方法 各组大鼠在规定时限前3 d开始腹腔内注射BrdU(50 mg/kg)，每日2次，共6次。制备局灶性脑缺血再灌注模型后2 h，对照组静脉注射PBS 2 ml，MSCs 组尾静脉注入MSCs 2 ml。MSCs +中药组于制备局灶性脑缺血再灌注模型后5 h静脉注入银杏、川芎制剂2 ml(5 mg/ml)，每日2次，48 h尾静脉注入MSCs 2 ml。 　　1.2.4 行为学检测 治疗后5、7、14 d用姿势反射实验和肢体不对称应用实验〔4,5〕评价大鼠神经功能障碍严重程度。肢体不对称应用实验：用于测试的器械为一直径18 cm、高30 cm透明的玻璃圆桶，正常大鼠在圆桶中会不时站立,用双侧前肢交替或同时触及桶壁,应用双侧前肢的频率应该相等。有缺血性脑损伤的大鼠偏瘫侧肢体应用较少，观察并记录双侧前肢的应用情况，对每只大鼠每次记录20次活动。以肢体应用的百分率 计算 最后得分，得分=(R-L)/(R+L+B)×100%，R:右侧前肢(健侧)独立应用次数;L:左侧前肢(患侧)独立应用次数;B:双前肢同时应用次数。姿势反射实验:距地面1 m提起鼠尾,观察其前肢屈曲情况，每次每只大鼠记录20次活动,评分标准：0分(正常)，双前肢完全伸展；1分(轻度异常)，左前肢贴向前胸,右前肢伸展；2分(重度异常):左前肢贴向前胸，上半身卷曲。每只大鼠每次的最后得分为20次评分的平均分。 　　1.2.5 免疫组织化学检测 各组大鼠开胸，行内固定，以视交叉和其后4 mm处两点行冠状切片，再次甲醛固定，经酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。使用双标免疫组化染色法确定由骨髓基质来源的细胞，按照SABCFITC检测试剂盒指导使用。切片用ZEiss LSM510激光扫描共聚焦显微镜检测切片，细胞核绿色，细胞质呈玫瑰红。 　　1.3 统计学分析 所有数据以x±s表示