青羊参多糖硫酸酯体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型活性研究.docVIP

　　青羊参多糖硫酸酯体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型活性研究 作者：姜海鸥，黄雪霜，王斌，张峻 【摘要】 　　目的 体外测定青羊参多糖硫酸酯抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的活性。方法采用 MTT法检测化合物对疱疹病毒感染Vero细胞的保护作用。结果青羊参多糖硫酸酯体外抗HSV-Ⅱ的EC50为69.9μg/ml， 治疗 指数为103。结论在体外，青羊参多糖硫酸酯有较显著的抗HSV-Ⅱ的作用。 【关键词】 青羊参多糖硫酸酯； 单纯疱疹病毒Ⅱ型； 抗病毒活性 　　Abstract:ObjectiveTo investigate the Anti-HSV-Ⅱ activity of sulfated polysaccharide from Cynanchum otophyllum SchnEid in vitro. MethodsVero cells Cynanchum otophyllum SchnEId Cynanchum otophyllum Schneid l and 103, respectively. ConclusionSulfated polysaccharide from Cynanchum otophyllum Schneid has obvious HSV-Ⅱ inhibitory effiect in vitro. 　　Key Cynanchum otophyllum Schneid；HSV-Ⅱ ; Antiviral activity 单纯疱疹病毒（HSV）是一种常见的传染性病原体，HSV-Ⅱ可引起外阴疱疹，是宫颈癌的协同诱因。阿昔洛韦（ACV）治疗人类HSV感染易产生耐药毒株［1］。因此，继续寻找高效、价廉的抗单纯疱疹病毒新药已势在必行。自1987年发现的硫酸酯化多糖具有抑制艾滋病毒HIV活性以来，多糖硫酸化的抗病毒活性研究成为热点［2］，但关于青羊参多糖硫酸酯的抗病毒实验研究甚少。本文对青羊参多糖硫酸酯体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的药效进行了实验研究。现报道如下。 　　1 材料和方法 　　1.1 试剂阿昔洛韦（acyclovir）购自湖北潜江制药股份有限公司；待测样品青羊参多糖硫酸酯由本实验室提供。MTT (3，4，5－dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)和十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）均购自Sigma公司，N，N-二甲基甲酰胺（N，N－Dimethyl formamine，DMF）购自上海试剂一厂。 　　1.2 溶液完全培养基为RPMI-1640（Invitrogen 公司），含有10%的小牛血清（Hyclone公司），2 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES，50 mmol/L 2-ME，100 u/ml的青、链霉素。磷酸盐缓冲液（PBS，0.01M，pH＝7.4）。 　　1.3 细胞和病毒Vero为非洲绿猴肾细胞，HSV-Ⅱ均由英国MRC惠赠。 　　1.4 病毒滴度测定　 　　将病毒悬液作连续10 倍稀释,常规方法感染单层Vero 细胞，37℃，5 % CO2 培养3 d，观察细胞病变( CPE) 情况, 按Reed-Muench方法 计算 TCID50。 　　1.5 以MTT法检测样品对Vero细胞的毒性 　　取对数生长期的细胞，离心（1,000 r/min，10 min）后将细胞重悬，细胞浓度调至2×106/ml。在96孔细胞培养板上将被检样品2倍倍比稀释，共设6个梯度，每个梯度设3个重复孔，另设阳性对照组及细胞对照组。分别加细胞悬液后，置37℃，5%CO2培养箱中孵育。于第4天用酶标仪（Bio-Rad 3550 ELISA reader）测定各孔的OD值（测定波长595 nm， 参考 波长655 nm）。按下列公式计算被检样品对细胞生长的抑制率，并计算IC50（50% inhibition concentration）值。 　　细胞生长抑制率（%）＝（1－实验孔OD值/对照孔OD值）×100% 　　1.6 MTT法检测 　　化合物对疱疹病毒感染Vero细胞的保护作用在96孔平底培养板上，将待测化合物用RPMI1640培养基进行2倍系列稀释。共6个稀释度，每孔100 ml, 设两个重复孔。同时设置不含化合物的未感染病毒的细胞对照组和感染病毒的病毒对照组；离心Vero细胞（1 000 r/min，10 min），用完全培养基重悬细胞，每孔加入75 μl 4×104细胞；感染HSV的每个稀释度中的两孔加入25 μl病毒，对照组加入25 ml培养基。每孔终体积200 μl；置37℃，5%CO2培养箱中培养，第3天补加100 μl新鲜培基；第6天将96孔细胞培养板低速离心