微生物限度检查法要点.ppt

（五）平皿菌落计数法 取均匀供试液，进一步稀释成1：102 1：103等适宜的稀释级。分别取连续三级10倍稀释的供试品液各1ml，置直径约9mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml ，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作2～3个平皿。 营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，前者同时点记霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点记细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。含蜂蜜、王浆的制剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。含糖的液体及半固体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。 （六）菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。 （七）检验程序 细菌、霉菌（酵母菌）检验程序 ? （八）供试液的稀释（10倍递增稀释法） ? 取2～3支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂。另取1支1ml灭菌吸管吸取1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即得1：100供试液。依此类推，根据供试品的污染程度，可稀释至1：103、1：104等适宜稀释级（至少共三级）。一般取1：10 1：102 1：103 三级稀释液检验。每递增一个稀释级，必须另换一支吸管。在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2支稀释管的内壁靠近液面（勿接触液面）缓慢地吹出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。 （九）注平皿 在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各1ml至每个平皿中，每一稀释剂注2～3个平皿。（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时做阴性对照（待各级稀释液注皿完成后，用一支1ml吸管吸取稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中两个作细菌阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。 （十）倾注培养基 将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂）溶化，冷至约45℃时， 倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使试液与培养基混匀，（注意，混匀时切勿将培养基溅到平皿边及皿盖上），置操作台上待凝。 （十一）培养 细菌计数平板倒置于30～35℃培养箱中培养48h，霉菌、酵母菌计数平板于25～28℃培养箱中培养72h 。 （十二）菌落计数 1．细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点记菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点记菌落数，一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，此平板不宜计数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。 2．一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间4～7天，细菌菌落常会生长增大而加以区别。 3．供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点记在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法须按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。 4．供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，（特别是1：10级别）培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落用肉眼相区别的有形物。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿 （1～2个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。［0.001%TTC肉汤琼脂培养基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂），在每1000ml营养琼脂内加入灭菌的1％TTC溶液1ml混匀后倾注平皿，防止菌落蔓延］。 有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬以白色背景上易于点计。 5．若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个菌落或2 个以