微生物学实验指导(10.10)要点.doc

实验 显微镜的使用一、 实验目的和内容目的复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术了解油浸系物镜的基本原理掌握油的使用方法。初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 ．制作细菌染色装片。 ．进行革兰氏染色法操作。 ．用油镜观察杆菌和菌染色装片。油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等油镜头上常刻有OIOil，Immersion）或HIHomogeneous immersion）字样，有的还有一圈红线或黑线标记低倍物镜、高倍物镜和油镜中，油镜的放大倍数和数值孔径numberal aperture）最大而工作距离最短图1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长成正比，与物镜的数值孔径NA）成反比. 从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。 数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度称镜口角，的一半正弦与介质折射率n）的乘积影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气n＝与玻璃n＝1.52的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油n＝1.515为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。 革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、实验材料和用具大肠杆菌(Escherichia coli)、(Bacillus thuringiensis)。 革兰氏染色液结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等、香柏油、二甲苯。显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 、操作步骤(一) 制片 1）涂菌 用无菌操作方法从中沾取菌一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1 cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 2）干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥温度不宜过高。 3）固定 将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止烧焦、变形。目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色 2. 染色 1）初染 于制片上滴加结晶紫染液，染1 min后，用水洗去剩余染料。 2）媒染 滴加卢戈氏碘液，1 min后水洗 （3）脱色 滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30 s 至1 min水洗 （4）复染 滴加石炭酸复红液复染1 min，水洗5）镜检 用滤纸吸干油镜镜检。 观察前的准备 1）将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4 cm。坐正。 2）调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。 低倍镜观察染色装片 首先上升镜筒，将染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至装片0.5 cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升或使镜台下降至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部分移至视野中心高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与相撞。再用目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。 油镜观察 1）提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位镜头的正下方滴香柏油。 2）从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。 3）将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌