微滴式数字PCR操作程序要点.docx

微滴式数字PCR操作程序操作方法1. 先打开电脑，再打开QX200 Droplet Reader电源，在使用前需预热至少30分钟；2. 配制探针法定量反应体系，振荡混匀，离心除气泡，注意20ul体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝较完整基因组DNA)，如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul，可提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度；3. 将一个新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口方向；4. 将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20ul 1×buffer control补足，建议使用Rainin的8通道20ul排枪和20ul枪头（不能用200ul枪头），加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡；5. 在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油（DG Oil），同样不能有空着的孔；6. 盖上胶垫（gasket），注意两边的小孔都要钩牢；7. 将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成；8. 微滴生成于cartridge最上面一排孔内，建议使用Rainin的8通道P‐50排枪和200ul枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40ul，将holder放平，枪头以与孔壁呈30~45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内（约5秒），枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的cartridge和胶垫；9. 转移油滴进入96孔板内完成后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜（膜亮面朝上，暗面向下），推荐的运行程序为：180℃，10s，无需颠倒方向二次封膜；10. 封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。推荐反应条件：1. 95℃，10min；2.94℃，30s 40循环Tm(退火温度按优化摸索得来的条件设置)，60s；3. 98℃，10min；11. 查看微滴读取仪上状态指示灯指示是否正常(不同说明书上稍有不同)；12. 将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，注意板斜角方位，如下图所示：13. 组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中，如图：14. 打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次Flush System，若一周以上未使用建议先做一次Prime再做Flush System。之后对96孔板中样品信息进行Setup，主要是提供实验名称、实验类型（ABS、CNV、RED）、assay以及探针信息等，完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze，人工核实后保存结果，即完成了一次QX100实验。