肾细胞癌及癌旁组织中TIP30蛋白的表达及临床意义.docVIP

　　肾细胞癌及癌旁组织中TIP30蛋白的表达及临床意义 【摘要】 目的 探讨肾细胞癌组织中Tat结合蛋白（TIP30）的表达及其临床意义。方法 采用SP免疫组织化学染色法对65例肾细胞癌组织及其癌旁组织中TIP30蛋白表达进行检测。同时采用的肾脏组织，并经病理学检查未见癌细胞。 　　肾癌石蜡标本取自我院2006年6月至2007年12月肾癌手术病例65例,均经病理组织学确诊,手术前均未接受化疗及放疗。其中透明细胞癌46例，颗粒细胞癌6例，混合细胞癌13例。年龄17～75(平均56.4)岁,男性46例,女性19例。局限于肾内者53例,穿透肾包膜者12例,有局部淋巴结转移者9例,有静脉癌栓形成者5例。Robson分期Ⅰ、Ⅱ期者53例，Ⅲ、Ⅳ期者12例。癌旁组织为距肿瘤组织≥5 cm处的肾组织。 　　1.2 试剂 兔抗人TIP30 IgG多抗购自英国Abcam公司,SP免疫组化染色试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。Western印迹试剂盒购自碧云天生物技术研究所。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 免疫组织化学 采用SP免疫组化染色法进行检测，主要操作步骤如下:石蜡切片标本经常规脱蜡,抗原高压修复,消除内源性过氧化物酶,山羊血清封闭非特异性抗原,加一抗(工作浓度为1∶100)4℃冰箱过夜,第2天切片恢复室温后,依次加生物素标记的二抗及链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液,DAB显色,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明封片。用PBS代替一抗作阴性对照。 　　1.3.2 Western印迹 在低温下使用研钵将新鲜肾癌组织及配对癌旁正常组织磨成粉末状，加入蛋白裂解缓冲液及蛋白酶抑制剂,离心吸出上清,分装,测蛋白浓度后置-70℃冰箱保存。配制聚丙烯酰胺凝胶,将变性蛋白样品加入缓冲液,蛋白凝胶电泳,然后转膜(PVDF膜)，用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜上的蛋白潜在结合位点,加入一抗(工作浓度为1∶400) 4℃过夜,加入二抗后ECL 试剂显色、照相。 　　1.4 结果判断 免疫组化结果以胞浆内出现淡黄色至棕黄色颗粒为阳性细胞标志，采用双盲法，计数10个高倍视野， 计算 阳性细胞占细胞总数的百分率。染色结果分为阴性(-):细胞无染色或很弱，阳性细胞率＜5%；弱阳性（+）：细胞染色为淡黄色，阳性细胞率为5%～25%；阳性（）：细胞染色强度介于弱阳性与强阳性之间，阳性细胞率为26%～50%；强阳性（）：细胞染色为黄色至棕黄色，阳性细胞率＞50%。Western印迹结果采用BioRad图像分析系统分析目的蛋白及内参蛋白的IOD 值，以相对积分光密度（TIP30的IOD值/GAPDH的IOD 值）比较蛋白表达高低。计算每组均值(x±s)，比较癌组织与癌旁组织间的表达差异。 　　1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件,两因素间的差异比较及相关性分析采用χ2检验。 　 　2 结果 　　2.1 TIP30蛋白Western印迹分析结果 Western印迹结果显示，TIP30蛋白在77.3%(17/22)肾癌组织中的表达水平明显低于对应的癌旁肾组织,在22.7%(5/22)肾癌组织中的表达水平与癌旁肾组织无明显差异。肾癌组与癌旁组比较，肾癌组蛋白相对表达量为0.405±0.152，明显低于癌旁对照组的0.712±0.193(P＜0.05)。TIP30分子量为30 kD，GAPDH分子量为40 kD。见图1。 　　图1 Western印迹检测TIP30蛋白在肾癌(C)与配对癌旁组织(N)中的表达差异（略） 　　2.2 TIP30蛋白SP免疫组织化学染色结果分析 　　2.2.1 TIP30蛋白表达与肾细胞癌侵袭、转移的关系 TIP30蛋白主要表达于胞质,阳性染色细胞呈浅黄色至棕黄色颗粒，在肾近曲小管和远曲小管表达量高(图2)。TIP30蛋白在肾细胞癌和癌旁组织都能检测到表达。65例肾原发癌组织中，TIP30蛋白阴性32例，阴性表达率为49.2%；65例癌旁组织中，TIP30蛋白阴性表达7例，阴性表达率为10.8%；12例穿透肾包膜的癌组织中，TIP30蛋白阴性表达9例，阴性表达率为75%；9例肾细胞癌转移淋巴结癌组织中，TIP30蛋白阴性表达6例,阴性表达率为66.7%；5例肾细胞癌静脉癌栓中,TIP30蛋白阴性表达3例，阴性表达率为60%。各组与原发癌组之间的差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。 　　图2 肾细胞癌及癌旁组织中TIP30 蛋白的表达(×400)（略） 　　表1 TIP30表达与肾癌侵袭、转移的关系（略） 　　与肾原发癌组织比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01 　　2.2.2 TIP30蛋白与肾细胞癌临床分期的关系 按Roboson分期，Ⅰ～Ⅱ期的53例肾细胞癌组织