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WB详细操作流程 朱德良 Western blot流程 蛋白样制备 配胶 电泳 转膜 封闭 一抗孵育 洗涤 二抗孵育 洗涤 化学发光显影 实验结果 试剂配制 （一）母液 1、1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 18.17g 超纯水 100ml 加超纯水溶解后，用浓盐酸调 pH至 8.8，室温下保存。 2、0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 6.057g 超纯水 100ml 溶解后，用浓盐酸调 pH至6.8，室温下保存。 3、10％过硫酸胺（APS） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1ml 溶解后，4℃避光保存，保存时间为 1周。 4、10％SDS SDS 1g 超纯水 10ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 5、30％Acr/Bic（29：1） 丙稀酰胺（Acr） 29g 双丙稀酰胺（Bic） 1g 超纯水 100ml 充分溶解后，0.22um滤器过滤，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 6、10 x TBS （20mM Tris , pH7.6） Tris 12.1g Nacl 40g 超纯水 500ml 加超纯水溶解后，用浓盐酸调 pH至 7.6，室温下保存。 （二）使用液 1、上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2ml β-巯基乙醇 0.8ml 10%SDS 3.2ml 甘油 1.6ml 0.05%溴酚蓝 0.4ml 混匀后4℃保存。 2、5X电泳缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5g 超纯水 1000ml 溶解后室温保存，此溶液可重复使用 3～5次。 （电泳液可以回收重复利用，一般内槽使用新鲜配制的电泳液，外槽可重复使用 3～5次。可以配制成 5×电泳液缓冲液进行保存，稀释5倍使用） 3、5X膜转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 72g Tris（MW121.14） 15.19g 蒸馏水至 1000ml 使用时加5X膜转移夜+甲醇+ddH2O=1:1:3 4、5XTBST 缓冲液（1 x TBS，0.1%Tween20） Tris 12.1g NaCl 43.85g 蒸馏水 1000 ml tween20 1xTBS加1000:1配置TBST 匀后即可使用，最好现用现配。 5、封闭液 （1 x TBS，0.1%Tween20，5%脱脂奶粉） 脱脂奶粉 0.5g 1 x TBST 10ml SDS 单位：ml 分离胶5ml（10%） 分离胶5ml（12%） 浓缩胶3ml ddH2O 1.8 1.6 2.1 30%胶母液 1.7 2.0 0.5 TRis-HCl 1.3(pH=8.8) 1.