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Western Blot 实验方法 一 蛋白提取 1、切取组织，置于已经用记号笔标记好的EP管底，称重（mg）插入冰盒中，注意不同样品间所用剪刀、刀片、镊子等要擦拭干净。 2、配置裂解液：980ulRiPA+10ul10%PMSF+10ul蛋白酶抑制剂 混匀机混匀。 每EP管中加裂解液(10ul/1mg)，超声（time --pulse--AMPL- -start--O）5s停5s循环1min ,振幅25%（AMPL参数） ,再裂解30min 。 于40C冷冻离心机中预冷15min，1200r/min.将裂解后的组织液离心15min，取上清即为所提蛋白，至于一个试管内，用酶标仪测浓度，再高温变性，再上样，多余的试剂置-80℃保存。 用玻璃小烧杯配制定量用的试剂：（2mlH2O+500ul考马斯亮蓝）+36ulH2O+4ul样品，另加一个标准品BSA(10ul/ml)对照组，一个空白对照组。 (4倍)上样缓冲液稀释成（1倍），即:30ul上清液+10ul(4倍)上样缓冲液（红色的 ，购买的），震荡混合+离心，高温振荡机中变性，950C，5min，注意使离心液全部流于底部，准备跑电泳。 测595nm吸光度，打开盖预热30min，每次都将空白校正0，读取标准品对照组，样品组的吸光度，尽快。比色皿水洗+酒精洗。 建Excel： （一）Cx=Ax/A标。C标（C标=10ug/ml ,由30ul稀释至40ul, A标已经知道的 ） （二）一般上样量为：30ug, 故: 30ug上样量/(0.75Cx)=V上样（ml） 由（一）（二），得：V上样=A标/Ax .4 二 配胶 提前配板：洗板，吹干，对齐，夹紧（向下压），配分离胶（两块板10ml），灌胶，压水，观察是否漏液，出现分界面，配浓缩胶（两块板4ml），若温度太低不易凝，可将分离胶中10%APS,TEMED同时加倍促凝.将配胶用烧杯洗净干燥，配胶 10％分离胶 5％浓缩胶 10ml(两快板) 15ml(三快板) 4ml (l两块板) 6ml(三块板) H2O 4.0ml 5.9ml 2.7ml 4.1 ml 30％丙稀酰胺 ml 5ml 670ul 1.0 Tris-HCL 2.5ml（1.5M，Ph8.8 0.50ml（1.0M，Ph6.8）10％SDS 100μl 40μl 60ul 10％APS（聚合剂，现配，灌胶前加入）100μl 40μl 60ul TEMED（加速剂，灌胶前加入）4μl 6ul 4μl 6ul 2、根据板子数计算所需胶的体积数，根据比例配制胶液，为铺胶平整下层胶铺好后立即UP水封，待胶干后倒去上层UP水并用滤纸吸干，按比例配制浓缩胶Western Blot实验 成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件： 凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析 处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上 处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测 成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下： 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性 内参对照：检测标本的质量和二抗系统 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果 ? WB检测基本过程 1、获取细胞或组织裂解物 1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer： 蛋白位置? 推荐buffer 全细胞 NP-40 or RIPA 胞浆（可溶性蛋白） Tris-