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姓名：任棉 学号：3110103857 同桌：魏澄 组号：11 日期：2012年12月26日 实验六、Duchenne型肌营养不良症DMD基因检测 【实验目的】 掌握PCR扩增技术。 掌握琼脂糖凝胶电泳技术。 【实验步骤】 正常对照DNA样本、DMD患者DNA样本，分别进行PCR扩增。 每一个薄壁PCR管中加入：（反应总体积为25μL） mixPrimer R+F(混合)DNA模板石蜡油双蒸水10×BufferMgCl2dNTPsTaq-DNA聚合酶17.8μL2.5μL2μL0.5μL0.3μL1.4μL0.5μL1滴2.PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳。 （1）配制2%的琼脂糖凝胶 配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4g的琼脂糖粉放入后，沸水锅加热熔化，冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/ml,混匀凝胶，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。 （2）向电泳槽中倒入1×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。 （3）取PCR扩增样品10μL加入3μL的6×载样缓冲液，混匀后加入样品孔内。 （4）接通电源，红色为正极，黑色为负极。DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负极），电压为1～5V/cm。140V,电泳2小时。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。 （5）卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准Marker Puc19/Msp I比较，判断扩增产物的有无及片段大小。 【实验结果】 本组为第3泳道，即DMD患者DNA样本为第8外显子缺失，泳道5、6、7、9、12都为正常对照。在图上可以观察到第8外显子对应的条带缺失，并且不能观察到第45、48外显子条带。 242bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 【实验讨论】 根据电泳条带可知，由于电泳时间不够长，在结束时，指示剂还未完全跑开，以至于第45和48外显子对应的条带不显现。 补充： PCR反应成分设置的原因： DNA模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。引物浓度过高易导致模板与引物错配，反应的特异性下降。Taq-DNA聚合酶量增加使反应特异性下降；但酶量过少影响反应产量。dNTP浓度取决于扩增片段的长度，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。dNTP可以与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的???性。 循环参数设置的原因： （1）变性：使双链DNA解链为单链 94℃ （2）退火：温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度可增加反应的灵敏性） （3）延伸：由扩增片段长度决定 （4）循环次数：取决于模板DNA的浓度，次数过多会使扩增效率降低，错误掺入率增加。