高渗透压环境下OREBP对AQP5的调控.docVIP

　　高渗透压环境下OREBP对AQP5的调控 【摘要】 目的： 探讨高渗透压环境下OREBP对AQP5的调控作用. 方法 ： 利用qRTPCR和LE15细胞OREBP和AQP5的mRNA和蛋白水平的变化 规律 ；运用RNAi技术抑制OREBP表达后，观察AQP5 mRNA及蛋白水平随高渗刺激的变化；探讨AQP5基因上游不同区域对Luciferase表达的启动及高渗环境下表达增强作用，用RNAi技术研究这种增强表达作用对OREBP的依赖性. 结果： 高渗透压刺激下，OREBP和AQP5的mRNA水平在12, 18 h达到峰值，两者蛋白水平也分别在12, 18 h达到峰值，RNAi抑制OREBP的表达后，AQP5对高渗的反应性消失. Luciferase实验表明在593至144区域内存在启动子，2563至2055区域存在ORE. 结论： 高渗透压环境下，OREBP通过与AQP5基因上游的ORE结合，调控AQP5的表达. 【关键词】 渗透压反应增强子结合蛋白；水孔蛋白5；渗透压反应增强子 0引言 水通道蛋白（aquaporin, AQP）家族由具有氨基酸序列同源性和两个NPA（AspProAla）结构域的13个蛋白组成（AQP0AQP12），其广泛存在于分泌细胞和吸收细胞，具有调节细胞水通透性的重要功能［1］. AQP5基因于1996年，被Lee等人成功克隆，该蛋白在肺，唾液腺和泪腺等组织呈高表达，特别是在成熟的肺泡上皮的1型上皮（alveolar epithelial type 1, AT1）中高表达，使AT1细胞相对于其他细胞具有更高的水通透性［2］. 近来，在体内试验中发现，AQP5同维持肺泡表面液体渗透压以及细胞体积密切相关，体外研究也发现高渗条件能诱导细胞株AQP5的高表达，同时也发现这一细胞反应同ERK依赖性通路有联系［3］，但高渗透压如何诱导AQP5上调表达的具体机制依然未知. 渗透压反应增强子结合蛋白（osmotic response elementbinding protEin, OREBP）是哺乳动物细胞内唯一已知的渗透压相关的转录因子. 在高渗环境下，OREBP 同一系列渗透压相关基因，如：肌醇，甜菜硷，肌醇转运蛋白等的渗透压反应增强子（osmotic response enhancer, ORE）结合，增强这些基因的表达，维持细胞的正常生理功能［4］. 有研究表明，细胞外高渗透压激活细胞内相关激酶： Fyn, P38, ATM等，使OREBP磷酸化，并进入胞核，启动相关基因表达［5-6］. 本课题探讨高渗透压环境下，OREBP与AQP5两者的mRNA与蛋白水平的相关变化规律，探讨OREBP对AQP5的调控作用及相关机制. 1材料和方法 1.1材料MEL15细胞株由Jeff I1640，L谷氨酰胺，FBS，青/链霉素合剂购自Gibco. 氢化可的松，转铁蛋白，雌二醇，硒盐，三梨醇等购自Sigma. Trizol，预染Marker, Lipofectamine2000购自Invitrogen，MMLV逆转录试剂盒为Promega产品，定量PCR试剂，引物及Taqman探针购自Applied Biosystems. 随机引物及PCR引物由上海生工合成，克隆用PCR试剂购自Strategene，限制性内切酶为NEB产品. OREBPsiRNA(NFAT5siRNA)，All Star negative control siRNA及siRNA转染试剂购自Qiagen. pGL4.18［luc2P/Neo］载体及Luciferase检测试剂盒购自Promega. 荧光定量PCR仪为Applied Biosystems 7300，荧光分光光度计为Perkin Elmer Victor3. AntiOREBP 购自Affinity BioReagents, AntiAQP5抗体购自Chemicon, CA. ECL试剂为Pierce产品. 其他常用试剂及设备本试验室提供. 1.2方法 1.2.1细胞培养按 2结果 2.1OREBP和AQP5 mRNA及蛋白水平随高渗处理的时相变化对数生长期细胞经高渗性培养基（500 mmol/L）处理0, 6, 12, 18, 24 h后，换回等渗培养基（300 mmol/L）处理6, 12 h. 7个时间点分别提取细胞总RNA和总蛋白，使用RealTime PCR 和 agni F, Sarto C, Ticozzi D, et al. Proteomic knoan aquaporins［J］. Proteomics, 2006,6(20):5637-5649. ［2］ Lee MD, Bhakta KY, Raina S, et