结构生物学(生物大分子解析方法).pptVIP

缺点：样品必须为晶体（单晶）,但生物大分子结晶困难,特别是膜蛋白和病毒等分子组装体结晶更是困难. 其次对于像病毒那样大的分子组装体,测量其精细结构十分复杂. 原因有二: 一是大晶胞含有的原子极多,X射线衍射点极多,常常无法区分、辨认和探测; 其二是大晶胞所产生的衍射点强度过弱,特别在高分辨时,无法与背景区分. NMR也是测定生物大分子结构重要手段 基本原理：核磁共振现象( nuclear magneticresonance spectroscopy ,NMR) 1946 年由哈佛大学的伯塞( E.M.Purcell) 和斯坦福大学的布洛赫(F.Bloch) 所领导的2个小组,用不同的方法在各自的实验室里观察到的,伯塞尔使用的实验方法是吸收法,而布洛赫使用的是感应法. 利用物理原理,通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质。NMR 不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法。由于不同的原子核吸收不同的电磁波，因而通过测定和分析受测物质对电磁波的吸收情况就可以判定它含有哪种原子，原子之间的距离有多大，并据此分析出它的三维结构。 以蛋白质为例,它的二级结构如α螺旋,β折叠、转角、环形和卷曲等,体现了蛋白质分子主链原子在三维空间各种不同的排列规律性. 位于不同二级结构域的原子核间距,原子核间的相互作用以及多肽段的动态特性,都直接反映蛋白质三维结构的特征. 这些具有不同结构特征的原子核间距、肽键二面角、肽键的动态特性等都具有特征的核磁共振谱线. 因此,我们分析核磁共振谱就可以获得蛋白质的三维结构. 1H,13C,15N是核磁共振检测的主要对象,各有不同的共振频率,从而形成核磁共振氢谱、碳谱和氮谱三部分. 核磁共振(NuclearMagnetic Resonance -NMR) 在水溶液中,大约有一半的蛋白质链呈现出规则、紧密的三维结构 ,而另一半则非常松 。目前,科学家已经利用这一方法绘制出15 %～20 %的已知蛋白质的结构。 最初,核磁共振技术主要用于核物理研究方面,用它测量各种原子核的磁矩,误差仅是0. 003 %～0. 005 %; 迄今,它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域,已成为在这些领域开展研究工作的有力工具,甚至是某些领域(如:化学、医学诊断、药物学等) 常规分析中不可缺少的手段。 1985 年,维特里希( Kurt Wüthrich）等人公布了第一次利用NMR 法测定的溶液中蛋白质-蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的结构(如图4 所示)。1990 年用NMR 测定的蛋白质结构有23 个,而到1994 年一年测定的蛋白质结构数上升到100个。1997 年,维特里希应用NMR 方法测定的一种蛋白质-蛋白感染素(prion protein) 的结构。 核磁共振方法的最大特点是可以直接在溶液中测定自然状态下的大分子三维空间结构，其分辨率已接近012nm ,但因为大分子量的生物分子的核磁共振图谱非常复杂,难以解释,因此它只能测量分子量较小(15-25kDa)的生物分子,至今最大可测定35kDa 的生物分子; 其次在测定中要求样品是高纯度且数量相对较多,使样品制备亦有困难;此外,核磁共振只能用于水溶液性的生物样品,对膜蛋白或病毒等的组装体、复合体就无法测定. 另一种方法称为冷冻电镜计算机三维重构方法或单颗粒技术（Cryo-EM）. 特点:急速冷冻(103 -104 ℃Ps) 样品悬液,样品被包埋在无定形的非晶态冰薄膜中,这样既不损伤样品,又可使样品保持着自然状态,因而样品制备简单。 缺点：分辨率稍低. 研究的病毒样品,目前分辨率接近0.17nm ,预计这几年内可达0.14nm. 核糖体可达1.10nm ,而离子通道可达2.10nm. 由于应用冷冻电镜与计算机重构技术研究病毒三维结构所需样品制备简单,对病毒的大小没有限制,使其发展很快,至今已有100 多个病毒的三维结构被冷冻电镜计算机重构方法所阐明,远远超过X射线晶体学的30-40种病毒的数量. 虽然其分辨率还有待提高,但所提供的资料和数据对于生命科学的许多研究来说,已经是十分宝贵和重要的依据,甚至已经满足了某些研究的要求. 如果把这种研究方法与用X 射线单晶衍射所获得的病毒衣壳高分辨三维结构结合起来那就更有意义了. 冷冻电镜计算机重构方法虽然其发展历史较晚,但特别有利于病毒、核糖体、离子通道等大的复合体、组装体等的结构与功能的研究,是结构生物学的新发展方向. 这些研究既是结构生物学的重要内容,又是正在走向综合的重要一步. Cryo-EM structure of prokaryotic 30S Translation Initiation Complex 3.6-Angstro