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NMR方法解析蛋白质结构 冯银刚 北京核磁共振中心 () 北京大学化学与分子工程学院 fyg@ yingangfeng@ 蛋白质结构层次 氨基酸通过肽键形成的生物高分子 一级结构、二级结构、三级结构、四级结构 核磁共振方法解析蛋白质溶液结构 测定原子（氢原子）之间的距离信息和其他约束信息，得到空间结构模型 化学结构（氨基酸序列，即一级结构）已知，测定空间结构（三级结构，四级结构） 适用范围——分子量 分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫时间减少（线宽增加） 同核二维1H谱：80氨基酸 异核多维（二维、三维）： 常规三共振（1H,15N,13C） 200氨基酸 氘标记，特殊标记 已报道有700氨基酸 同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备 标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备 常规样品 浓度：毫摩尔每升 500uL 10kDa ? 5毫克每样品 均一 没有聚合 水溶液（10%重水锁场） pH7.5 常用缓冲体系：Tris-HCl, 磷酸盐，醋酸盐 稳定性：室温下大于一周 NaN3 蛋白酶抑制剂 蛋白质的一维谱 同核方法 指认方法不同：2D 1H-1H 两种样品：H2O, D2O 实验 TOCSY, COSY, NOESY 自旋系统指认，序列指认 指纹区：HN-HA每个残基一个峰 同核方法指认 三共振方法—以杨树谷氧还蛋白C1为例 实验之前——蛋白质基本性质 杨树谷氧还蛋白C1 (Grx-C1) 分子量：117个氨基酸残基，12.5kDa 等电点：8.49 同源性：~35% 功能：谷胱甘肽依赖的氧化还原酶 稳定、无聚合 样品制备——分子生物学方法 基因克隆：cDNA?质粒载体 蛋白质表达纯化 大肠杆菌E. coli BL21(DE3) 离子交换色谱，凝胶过滤 纯度：SDS电泳上为单一条带 同位素标记 使用M9培养基：无机盐，葡萄糖 15N NH4Cl, 13C 葡萄糖 样品 ~1mM 蛋白质 磷酸钾缓冲液，pH6.4 ， 90%H2O/10%D2O 0.01% DSS （化学位移校准） 40mM DTT，0.01% NaN3，蛋白酶抑制剂 数据采集 谱仪 Bruker 500MHz, 600MHz 三共振探头 采集用于解析一个蛋白质所需要的全部谱图时间约1~2月 数据处理 处理的内容： 线性预测－加窗函数－充零－傅立叶变换－相位校正－基线校正 在线与离线处理 二维谱：每个约几兆 三维谱：每个几十兆到几百兆 nmrPipe 多维谱的处理：每一维都要分别进行傅立叶变换 化学位移校准 重要性 1H使用 DSS (2,2-dimethylsilapentane-5-sulfonic acid sodium salt) 异核：间接校准 以DSS的0 ppm处的频率乘以换算因子得到异核的0 ppm的频率 NMR初步鉴定 蛋白质折叠程度 NMR初步鉴定 1H-15N HSQC 分散程度：折叠程度 确定谱宽 指认基础：每个氨基酸（除脯氨酸外）都在HSQC上有一个峰 三维实验（双共振、三共振） 减少谱峰堆积 利用异核之间较大的耦合常数 基于J耦合进行共振指认，减少对空间构象的依赖 三维实验 绝大多数异核多维实验可以类比于二维COSY, TOCSY, NOESY及其组合 主链指认实验 侧链指认实验 NOE实验 化学位移指认 化学位移：每个原子的身份证 主链指认 序列连接 氨基酸类型判断 主链指认 HNCACB-CBCA(CO)NH 化学位移指认 侧链指认 3D TOCSY或 COSY H(C)CH-TOCSY 芳环 (HB)CB(CGCD)HD (HB)CB(CGCDCE)HE 通过NOE确认指认 主链 侧链 用于Grx-C1指认的实验 主链指认：2D 1H-15N HSQC, 3D HNCA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO ~10天 侧链指认：2D 1H-13C HSQC, 3D HBHA(CBCA)(CO)NH, (H)C(CO)NH, H(C)(CO)NH, 1H-15N TOCSY-HSQC HCCH-TOCSY, CCH-TOCSY, HCCH-COSY, CCH-COSY, 2D (HB)CB(CGCD)HD, (HB)CB(CGCDCE)HE ~20天 NOE：3D 15N NOESY-HSQC, 13C NOESY-HSQC(for aliphatic region), 13C NOESY-HSQC(for aromatic region) ~10天 Grx-C1指认结果 1H,15N,13C指认率：98% 1H-15N HSQC 上所有谱峰得到了指认 J. Biomol.