第五讲 组.ppt

2 冰冻前的预处理 对材料进行抗旱锻炼或预培养能增强细胞的存活率。 预处理措施： 继代及同步培养； 在高渗或冰冻保护剂培养基上预培养； 零上低温驯化 * 3 冰冻保护剂 冰冻保护剂的使用能减少超低温保存造成的伤害。 保护剂的作用： 降低冰点； 增强溶液黏性，防止冰晶生长； 促进细胞在结冰早期进行保护性脱水。 常用的冰冻保护剂DMSO、甘油 * 4 冷冻速度 慢冻法：样品以0.1~10度/min的速度缓慢降至-30~-40度，平衡一段时间后转入液氮保存； 适用于悬浮细胞和原生质体。 快冻法：直接投入液氮中冷冻，温度下降速度300~1000度/min； 适合含水量比较少的材料，如花粉、种子、枝条。 * 逐级冷冻法：起先以较慢降低速度降温使细胞失水达到保护性的脱水，形成高浓度的溶质，然后分级降至-30度、-70度、-100度、-196度。 干冻法：通过控制脱水速度和脱水程度，对植物材料进行干燥处理能增强抗冻性。 一般用真空干燥法进行干燥，干燥后投入液氮保存。 * 5 贮存 从理论上讲，只要保证不断补充液氮，就可以长期保存冷冻的材料。但是有文献报道，随着时间的延长，冷冻茎尖的生活力下降。 * 6 解冻 贮藏于液氮中固定样品，缓慢升温时，细胞内会再次结冰，危险区大概在-50~-10度。 实验表明，冰冻过的材料在35~40度水浴中解冻比在室温解冻效果好。 冰冻的材料细胞很脆弱，解冻时应避免剧烈摇动。 * 7 解冻后的处理 解冻后残留于细胞的冰冻保护剂会影响材料的恢复生长，所以需要除去保护剂； 但是没有必要连续洗涤，多次洗涤对细胞的伤害往往会更大。 * 8 解冻后活力测定 再培养； FDA染色； TTC染色：检测细胞内脱氢酶活性 * 人工种子 * 体细胞胚与人工种子 体细胞胚是由植物体细胞培养产生的类似于合子胚的结构； 把离体培养产生的体细胞胚或能够发育成完整植株的分生组织包埋在含有营养物质和具有保护作用的外壳中，在适宜的条件下就可以长出幼苗，这种类似于天然种子的结构称为人工种子。 * 人工种子的结构 1 胚状体 类似于天然种子的胚，主要是组培产生的胚状体、愈伤组织、小鳞茎等； 2 人工胚乳 相当于组培中的培养基，提供营养和激素； 3 人工种皮 透水透气，固定成型，耐受机械损伤 * 人工种子的意义 可以使在自然状态下不结实或种子昂贵的植物得以繁衍； 固定杂种优势； 快捷高效的繁殖方式； 可人为控制植物的生长发育和抗逆性。 * 人工种子目前只在一些模式生物如胡萝卜、苜蓿等植物中有成功报道； * 本节完下节内容 细胞培养及其应用 * 叶片症状： 花叶症状，病毒侵染后叶片不均匀褪绿； 黄化症状，侵染病毒后叶片变黄； 环斑及蚀纹，叶片出现单环纹或双环纹环斑，叶片上出现不规则纹线症状称为蚀纹。 * 发育异常 畸形，叶片扭曲、皱缩、卷叶 坏死，整个组织、器官或植株死亡 * 如何应对病毒病 对于病毒病，目前并无有效防治措施； 利用茎尖分生组织脱毒培养，可以获得脱毒苗，恢复植物固有的优良性状。 脱毒苗再通过克隆繁殖可以获得大量脱毒的优良种，供生产上使用。 * 脱毒技术1 热处理脱毒 利用病毒和寄主植物对高温的忍耐程度差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分不含病毒的分生组织，进行无毒个体培养。 热处理脱毒的原理： 将植物置于高于正常温度环境中，组织内部病毒部分或全部钝化，但寄主植物细胞很少或不受到伤害。 * 高温钝化病毒主要表现在： 高温可断裂病毒RNA； 病毒内部酶裂解，造成病毒颗粒破坏； 辅助酶钝化，如RNA聚合酶钝化导致RNA合成受阻； 高温下蛋白质结构发生变化，病毒不能正确组装； * 热处理脱毒处理温度的时间因物种和器官的生理状态而异，一般35~40小时，短则几十分钟，长可达数月。 * 热处理方法 热水处理： 热水处理对休眠芽效果比较好 热空气处理： 对活跃生长的茎尖效果好，既能消除病毒，也能使寄主植物有较高的存活机率。 把旺盛生长的植物转移到35~40度的热疗室处理一定时间，热处理后要立刻把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上。 * 热处理脱毒的局限性 并非所有的病毒都对热处理敏感； 延长寄主植物的热处理时间，也会钝化植物组织中的抗性因子； 热处理以后仅有一小部分植株能够存活。 * 脱毒技术2 2 茎尖脱毒培养 植物茎尖不存在病毒，或病毒数量、种类少； 病毒的复制速度不及茎尖细胞的生长速度，病毒难以进入到分生组织中。 茎尖培养是生产无毒植株最重要、最有效的组培方法，在草本植物上广泛应用，在十几种木本植物上也取得了成功。 * 脱毒培养的方法 1 从带病植株上切取茎尖、芽尖作为外植体，常规消毒后在培养基上培养成小植株，经过脱毒检测以后，将脱毒苗