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地被菊直接体细胞胚发生的优化 　　摘要：为进一步优化地被菊叶片直接体细胞胚发生体系,从诱导培养时间、不同蔗糖浓度以及不同激素等方面对地被菊“玉人面”进行了研究。结果表明：叶片诱导7d后转入发育培养基,直接体细胞胚诱导阶段用10g/L的蔗糖,发育阶段用30g/L的蔗糖,体细胞胚发育时去掉NAA；优化使得叶片在直接体细胞胚诱导及发生过程中没有薄层愈伤的出现,体细胞胚在分化出苗以前叶片表面没有根的形成,而且苗生长健壮,没有玻璃化的出现。达到直接体细胞胚发生优化的目的。 　　关键词：地被菊；体细胞胚；诱导；愈伤 　　收稿日期：2011-04-25 　　基金项目：武汉市科技攻关项目（编号：200851799524-02）；武汉市2008重大科技创新专项；湖北省攻关项目（编号：2004AA201C15）； 　　湖北省自然科学基金项目（编号：2004ABA150）资助 　　作者简介：蒋 凡（1984―），男,湖北钟祥人,广西大学林学院林木遗传育种专业硕士研究生。 　　中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2011）05-0216-04 　　1 引言 　　体细胞胚的诱导主要有两种途径：一是直接由叶片的叶脉及脉间表皮细胞分裂产生（直接类型）：二是首先由茎段脱分化成愈伤组织,然后由这些愈伤组织的某些细胞形成体细胞胚（间接类型） ［1］。由叶片的表皮细胞分裂产生体细胞胚,取材容易,诱导体细胞胚的速度快。 　　直接体细胞胚发生途径形成的体胚,发生频率高,无畸形胚产生,生长健壮,分化能力强,成苗率高,而且直接体细胞胚的再生植株变异频率低［2］。直接体细胞胚具有很强的接受外源DNA的能力,是理想的基因转化感受态细胞；而且胚性细胞繁殖量大,同步性好,转化后的胚性细胞可顺利发育成胚状体及完整的转基因植株。大量研究表明,直接体细胞胚发生多是单细胞起源,转化获得的转基因植株嵌合体少［3，4］,因此,植物通过直接体细胞胚发生形成的体细胞胚可作为理想的遗传转化受体体系［5，6］。 　　蒋细旺等［7］在对地被菊“玉人面”直接体细胞胚发生研究中发现,叶片经体细胞胚诱导培养基（MS+KT 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L） 诱导10 d后,发现有薄层愈伤的出现,转接到体细胞胚发育培养基（MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L） 中,13 d后,发现有大量淡黄色颗粒突起,同时愈伤量会增多,到15 d时发现有大量芽点出现,到17 d时发现有大量芽出现,到24 d时,又有一批球状颗粒突起,到30 d时,能显著观察到分化出两批植株,高度相差约5 mm,高度比值约3～4倍。这两批植株的出现时间相差大约7～10d。而且由上述诱导的体细胞胚再生出的苗容易玻璃化,体细胞胚发育为芽之前,叶片外植体表面上容易生根,由体细胞胚发生途径转化为器官发生途径；薄层愈伤的出现,也会有一部分体细胞胚是间接体细胞胚发生。 　　由于3种方式发生的时间不一致,在遗传转化时,农杆菌侵染的最佳时间也会有差异,而使转化效率低下。目前对地被菊直接体细胞胚发生中出现器官发生途径及间接体细胞胚发生途径该如何克服的研究较少。达克东［8］在苹果离体叶片培养诱导直接体细胞胚胎发生研究中发现,2,4-D 是使外植体产生薄层愈伤组织的原因之一,叶片在含有2,4-D 的培养基中处理时间过长是使外植体产生愈伤组织的原因之二,通过缩短胚性细胞诱导时间和减少诱导培养基中蔗糖量来减少叶片直接体细胞胚发生中的间接体细胞胚发生的百分率来得到优化。而张健［9］通过提高诱导培养基中的蔗糖浓度到（5%～10%）,来提高柑桔幼胚的直接体细胞胚的诱导率来得到优化。马国华［10］在木薯嫩叶直接诱导初生体细胞胚胎发生和芽的形成的研究中,发现NAA不仅能够诱导木薯嫩叶产生体细胞胚,而且能够直接诱导芽的形成,其它几种生长素类化合物如2,4-D、dicamba或picloram等只能直接诱导体细胞胚胎发生,所不同的是这种NAA诱导的木薯体细胞胚胎发生和芽的器官发生几乎是同步进行的,但它们之间在形态上和植株再生的时间及方式上存在较大的差异。 　　2 材料与方法 　　“玉人面”‘Yurenmian’（白花）由北京林业大学陈俊愉院士提供。MS培养基为基本培养基,试验激素分别为2,4-D（2,4二氯苯氧乙酸）、KT（激动素）、NAA（萘乙酸）。 　　2.1 无菌苗的获得和叶片外植体的准备 　　按蒋细旺等［11］的方法和培养条件获得无菌苗并继代。从新增殖（4周左右）的幼苗上切取嫩叶,并去除叶缘切成约0.5cm2的叶片,以近轴面接触培养基。每培养皿接种25个外植体,重复5次。 　　2.2 玉人面的诱导培养时间对体细胞胚发生的影响 　　按蒋细旺等［7］的方法和培养条件