细胞冻存复苏及腹水制备-LM.pptVIP

腹水制备操作技能与注意事项;第一章，认识我们的工作 一，我们的主要工作是什么 二，为什么要制备腹水 三，腹水产生的原因 四，为什么要注射石蜡;;我们主要制备的腹水有三类： 1，研发性：即小样，要求注射两只小鼠，至少5ml腹水。 2，中 样：从小样里面筛选出来的细胞株，一般要求5只。 3，生产性：供应生产用的腹水。 腹水制备的原则：保质保量！ 对我们的要求：必须要有高度的责任心。;目前，大量生产单抗的方法主要有两种：　 1，体外培养法，从上清中获取单克隆抗体 （1）悬浮培养法： 和常规静置培养相比，增加了细胞生长空间，使单位体积内细胞数量增多，从而增加抗体量。 （2）固相培养法： 单层培养和悬浮培养的结合，主要用于贴壁性较强的杂交瘤细胞，以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，细胞固定在载体表面生长。 体外培养法优点：工艺简单，易于控制，目前上市的单抗多用此法。 体外培养法缺点：抗体浓度低，一般含量为200～500μg左右。;2. 动物体内诱导法 （1）实体瘤法： 将对数期细胞按(1～3)×107个/ml接种于小鼠背部皮下，多点注射，待肿瘤达到一定大小后可采血获得抗体，一般1～10mg/ml，缺点是采血量有限。 （2）腹水制备法： 腹水抗体的浓度达2～5 mg/ml，一般可以抽取5ml左右腹水。 该法优点：操作简单、经济，是一般用途单克隆抗体制备的首选方法，一般用于生产科研或诊断用的单克隆抗体。 ;三，腹水产生的原因： 1，杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，大量肿瘤细胞在腹腔中生长，分泌很多刺激性的因子，胶体渗透压升高，导致腹水产生。 2，杂交瘤细胞的生长对腹膜是个刺激，引起炎症反应导致腹膜上的毛细血管通透性增加，体液漏出，形成腹水 。;; 注射液体石蜡注意事项： 1，拿小鼠姿势正确，不要被咬伤。 2，不要将针头对着其他人。 3，石蜡不能注射到皮下。 4，注射石蜡时要注意石蜡的量（0.5ml）。 5，发现不同性别小鼠时要将其分开。 6，注射完毕后要及时做好标记。 7，发现缺水少食时应及时提醒添加。;第二章，细胞的复苏 一，确定复苏的细胞数 二，制备适量的饲养细胞 三，细胞的复苏 四，细胞复苏的注意事项;一，首先确定复苏的细胞数 1，比较紧急的项目 对于研发性腹水一般要先和领导沟通确定哪些项目紧急，紧急的项目要随时准备复苏。例如，目前紧急的有肿瘤系列细胞如CA153CR，CA724，colo205等。中样腹水一般由领导直接下单子。 2，根据实际情况自行安排 一般按项目进行复苏，先紧同一个项目复苏，切忌不要同时复苏多个项目，这样容易弄乱，并且交接时比较麻烦。;二，制备适量的饲养细胞 确定完复苏的细胞数量后就要准备饲养细胞，一般一只小鼠的饲养细胞可以配置100mlDMEM培养基，根据细胞数量的多少确定小鼠的数量，加样备用。目前，一般情况24孔板1.5ml/孔，6孔板5ml/孔，大平皿30ml/板。 注意事项： 1，培养液和血清必须用新的，并记录批号。 2，制备过程严格无菌操作。 3，第二天确定没有污染后方可使用。;三，细胞的复苏 1、将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温，回温后以75%酒精消毒，移 入无菌操作台内。 2、取50ml离心管，加入细胞冻存前所用基础培养液5ml。 3、根据复苏申请单，由细胞管理员将细胞从液氮中取出，细胞使用人核对后，立即放入37 ℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以75%酒精消毒?，移入无菌操作台内。 4、取出复苏细胞悬浮液，缓缓加入已准备的培养液中，混合均匀后， 1500rpm离心5min。 5、将离心管取出，弃去上清，用含血清培养基重悬后,加入6孔板或小号平皿中，观察细胞复苏时状况并记录，37℃ 5%CO2培养。 6、次日观察有无污染。;以下原因可能导致复苏失败： 1，饲养细胞有污染却没有发现。 2，细胞在水浴锅中时间过长或水进入冻存管。 3，操作过程存在污染。 4，没有更换枪头，导致交叉污染。 5，没有记录细胞的名称及其编号或者有重号现象。;四，细胞复苏的注意事项： 1，所用器材经过高压处理，培养基和血清是新的。 2，整个过程保证无菌操作。 3，复苏的关键是速融，一般在1min内。 4，及时更换枪头，避免交叉污染。 5，及时记录细胞的名称及其编号批号，切忌弄混。 6，复苏完毕后重新核实复苏的细胞名称和编号批号。 7，填写复苏记录表。 ;细胞复苏时机的选择： 平时一般选取在周五，原因：一般情况周五复苏后下周一会有一半细胞可以注射小鼠，一般三四天可以全部注射完，7天后的周一开始抽取，这样周末就不会太忙。假期前要