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一、新固定相 随着HPLC 技术应用的日益广泛，固定相的发展也越来越迅速。在70 年代 早期，HPLC 法所用的固定相一般是40µm 薄壳非多孔基质上涂布，能承受的压 力约为100~500 psi ，理论塔板数大约为1000m-1 。70 年代末期，产生了10µm 不 规则微多孔填料，能承受 1000~2500 psi 的压力，理论塔板数为25,000 m-1 。从 80 年代到现代，填料的粒度达到了3.5~5µm ，承受的压力可高达1500~4000 psi ， 理论塔板数也达到了50,000~80,000 m-1 。 1. Waters 公司采用桥式杂化技术获得的HPLC 新固定相 OH OH OH OH OH OH OH OH H C CH 2 2 Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si O O O O O O O O O O O H C CH O O O 2 O O O O 2 O CH H C 2 2 O Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si O O O O O O O O O O H C CH 2 2 O O O O O O O O 其颗粒粒度为1.7µm ，有更高的反压耐受性 （15000psi ），适用于更宽的pH 范围，有更高的柱效。 例：普通HPLC ：4.8 µm ，峰数 = 70 ，峰容量Pc = 143 1 UPLC™ ：1.7 µm ，峰数 = 168，Pc = 360 ，2.5 倍 2. 美国安捷伦 （Agilent ）公司研制的ZORBAX 快速分离高通量 （RRHT ）色谱 柱，填充1.8¦Ìm 的全多孔材料，可耐受600bar 的压力，实现超高速，高分离度。 填充有 stablebond 固定相的ZORBAX 快速分离高通量色谱柱在 100℃仍保持稳 定。 例：分别用5¦Ìm ，3.5¦Ìm 和1.8¦Ìm 的RRHT 色谱柱在相同条件下分离一混合 物中的杂质结果见图 使用 1.8¦Ìm 的RRHT 色谱柱能分离出更多的杂质，并使其分离度和柱效大 幅度提高，实现了快速，高通量分离。 二、定量分析方法 为了保证定量分析的准确性和重现性，色谱系统应达到一定的要求。《中华 人民共和国药典》2010 年版规定的色谱系统适用性内容包括：理论塔板数、分 离度、拖尾因子 （对称因子）和重复性。 2 HPLC 的定量分析方法也与GC 的相似，但少用归一化法，常用外标法和内 标法进行定量分析。而在粗略考察药物中杂质含量时也用不加校正因子的归一化 法。 1．外标法 是以对照品的量对比求算试样含量的方法。只要待测组分出峰、 无干扰、保留时间适宜，即可用外标法进行定量分析。在HPLC 中，因进样量较 大，且用六通阀定量进样，误差相对较小，所以外标法是常用定量分析方法之一。 与GC 中一样，外标法可分为校正曲线法，外标一点法及外标两点法等，前两种 方法常用。 实际工作中，校正曲线常用来考察方法的线性，以回归方程的相关系数表示。 回归方程为： A=a+bC 峰形为正常峰时，峰面