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细菌的简单染色和革兰氏染色 生93 沈睿 2009012372 同组成员：赵磊 徐鲁斌 实验日期：2011-3-17 一．实验目的 1. 掌握细菌涂片的制备方法 2. 掌握细菌简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤 3. 学习无菌操作技术 二．实验原理 1. 细菌的简单染色 细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染 料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细 菌所带正电荷易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。简单 染色法即在染色过程中只用一种染料。 2. 革兰氏染色 - 细菌根据细胞壁结构可以分为两类，一类 （G ）细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的 脂类物质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，当用乙醇脱色时，脂类物质被溶解，细 胞璧通透性增加，甲紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌被脱色，再经番红复染就 + 变成了红色。另一类（G ）细胞壁中肽聚糖层后且交联度高，脂含量少，经脱色反 而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留原来颜色。 三．实验器材 1. 普通光学显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、擦镜纸、擦镜液、镜油、无 菌牙签 2. 菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、未知菌种S1、未知菌 种S2 3. 草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95% 乙醇溶液、番红染液 四．实验步骤 1. 载玻片处理：洗净的载玻片浸泡在75%乙醇中，取一块纱布擦干，在涂菌位置的背 面用记号笔画圈标记，涂菌部位用火焰烤，可除去油脂。 2. 涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，于载 玻片中央涂成薄层（背面有圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接 种环从斜面上 （或用无菌牙签从口腔里）挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀， 涂成一薄层。注意在拔或塞试管塞时，应将试管口在火焰处略加烧灼，最后将接种 环在火焰上烧灼灭菌。 3. 干燥：涂片后室温下自然干燥，也可酒精灯上略加温，迅速干燥，但勿靠近火焰。 4. 固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速 来回移动3-4 次，共约3-4 秒。要求玻片温度不超过60oC，以玻片背面触及手背皮 肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。 5. 染色： 初染：滴加 1 滴结晶紫染液，染色 1 分钟，水洗，吸干。（至此步骤后，直接进行 镜检即为简单染色法的操作过程，但在简单染色中的可使用各种染液） 媒染：再加1 滴碘液覆盖涂片1 分钟，水洗。 脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加95% 的乙醇脱色，轻轻摇动玻片 直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 复染：滴加蕃红染液复染约2 分钟，水洗。 镜检：吸干水后，盖上盖玻片观察标本，注意细菌形态、大小、排列和颜色。 五．实验结果 1．普通染色结果 图1 枯草芽孢杆菌 （400 ×） 经草酸铵甲紫普染呈现紫色，另有特殊结构芽孢（箭头所指） 2．革兰氏染色结果 1）枯草芽孢杆菌 图2 枯草芽孢杆菌 （1000 ×） 染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌，另有特殊结构芽孢（箭头所指） 2 ）大肠杆菌 图3 大肠杆菌 （1000 ×） 染色结果为红色，是革兰氏阴性菌 3 ）金黄色葡萄球菌 图4 金黄色葡萄球菌 （1000 ×）