第十八章电泳1.ppt

纯化篇鉴定篇 蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术,是确定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。首先要根据它的基本性质进行分离纯化，最终对其纯品进行分析鉴定。 2 蛋白质的等电点测定技术 (1) 等电聚焦电泳(Isoelectrofocusing,IEF) (2) 聚焦层析(chromatofocusing) (3) 离子交换层析 离子交换柱 →平衡 →上样 →pH梯度洗脱 →测定洗脱峰pH值 第十八章 电 泳 Electrophoresis 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。 带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质及数目等因素有关。 电泳技术的发展过程 电泳现象早在1808年就已经被发现，但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家Tiselius A首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模式。 他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，以支持介质为主的电泳模式不断涌现（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等). 60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。 1967年Shapiro A L等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。 70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展. 多年来科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作，采用染色、扫描、紫外吸收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析，得到所需数据。 30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。 电泳的分类 电泳装置主要包括两个部分： 电源和电泳槽。 主要内容 基本原理 蛋白质电泳 核酸电泳 第一节 基本原理 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 第五节 聚丙烯酰胺凝胶电聚焦 第八节 双向电泳 第七节 印迹法（转移电泳） 第三节 核酸电泳 第六节 毛细管电泳 第一节 基本原理 在电场中被分离物质的泳动速度除受本身性质如所带电荷的性质和数量、分子本身的大小和形状、分子的水化程度、解离趋势等影响外，还与其它外界环境因素有关。 1 电场强度的影响： 电场强度是指电场中每厘米的电位降，也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起着重要作用，电场强度高，带电颗粒泳动速度快，电场强度低，带电颗粒泳动速度慢。 2 溶液pH值的影响： 大部分生物大分子都具有阳离子和阴离子基团，这些基团的解离常数不同，溶液的pH值决定被分离物质带电基团的解离程度，所以生物大分子的净电荷取决于环境的pH值。pH影响着生物大分子的电泳迁移率，溶液的pH值距离蛋白质的等电点pI越远，蛋白质带电性越强，泳动速度越快；pH值距离蛋白质的pI越近，蛋白质带电性越弱，泳动速度越慢。电泳时为保持pH恒定，必须采用缓冲液作为电极缓冲液。在分离蛋白质时，要选择合适pH的缓冲液，使待分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大差异，有利于彼此分开。 3 溶液离子强度的影响：