PCR原理及操作.ppt

DSBK DSBK PCR原理及操作 主要内容 一、PCR技术的基本原理 二、PCR反应体系及反应条件 三、PCR在HLA-SBT中的策略 四、检测流程及操作注意事项 五、实验结果分析 变性退火 延伸 二、PCR反应体系及反应条件 琼脂糖凝胶电泳 三、PCR在HLA-SBT中的策略 HLA Class I (A, B and C) SBT: HLA Class II (DRB1 , DQB1) SBT: 位点 A B C DR DQ AK BK CK DR1-1 DR1-3 片段大小（bp） 3k 2.9k 3k 300左右 3.5k 2k 2k 2k 检测外显子 2~4 2~4 2~4 2 2 3 2 3 2 3 2 3 1 3 常规HLA配型位点信息 PCR反应参数的设置 A、B、C DRB1常规 DQB1 96oC 2min 2min 95oC 2min 95oC 30sec 30sec 93oC 15sec 60oC 30sec 30sec 60oC 30sec 72oC 3min 30sec 68oC 3.5min 15oC ferver ferver 15oC ferver 四、检测流程及操作注意事项 MIX 配制 配制MIX前先将所需的试剂准备好，使用前振荡并离心。 将移液器、枪头等实验用品按要求摆放整齐 MIX的配制中酶最后加入。 为防止漏加或重复加样，每加入一种试剂后，在该试剂用量数字后打勾做标记。 模板分装 根据《PCR反应表》所编的模板位置来编排相应的PCR板。 加模板前将DNA振荡离心，按照对应的DNA条码号在离心管架上排列好存放模板的离心管的顺序，并复核一遍，以确保模板顺序与《PCR反应表》一致。 样品应加到反应孔底部，并注意不同样品要换枪头。 加完样品后检查是否加错或漏加 MIX分装 反应板上所标的位点选择相应的MIX； 加MIX时移液器保持垂直，加同样的MIX时可不更换枪头； 若枪头尖端有较多试剂悬挂，应让枪头贴壁后更换新枪头，防止接触到模板而造成污染; 分装完成后，从孔板底部观察是否有漏孔，若有漏加应选用相应位点的MIX补加; 胶垫方向与反应板一致，列数编号对应。 电泳 五、实验结果分析 （1）不出现扩增条带 原因： 1、模板质量（含有抑制物，浓度纯度低） 2、引物质量（错配，引物降解） 3、人为原因（体系错配，扩增程序有误） 对策： 1、纯化模板或重提或加大模板用量 2、更换新引物 3、重做 （2）出现非特异性扩增带 原因： 1、引物特异性差 2、模板或引物浓度过高 3、酶的质量差或量过高 4、Mg2+浓度过高 5、退火温度偏低 6、循环次数过多 对策： 1、重新设计引物 2、降低模板或引物浓度 3、减少酶量，更换另一种酶 4、降低Mg2+浓度 5、提高退火温度 6、减少循环次数 （3）出现片状拖带或涂抹带   原因： 1、模板不纯 2、buffer不合适 3、退火温度偏低 4、酶量过多 5、dNTP、Mg2+浓度偏高 6、循环次数过多 对策： 1、纯化模板 2、更换buffer 3、适当提高退火温度 4、适量用酶 5、适当降低dNTP、Mg2+浓度 6、减少循环次数 PCR操作中出现的错误、原因及后果 PCR操作中出现的错误、原因及后果 由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而影响实验结果。 实验前后都要做好清洁工作，如实验前桌面用清水酒精擦拭，实验后擦次氯酸钠，照紫外，通风，垃圾处理等。 注意事项 注意事项 检查程序 上机前要检查程序是否有更改。 上样 要保持在同一高度上，保证受热均一以避免边缘效应。 热盖 应压紧以免硅胶垫不紧导致样品蒸干，但不可拧得过紧导致反应管变形。 DSBK DSBK