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八、生物工程 一、基因工程知识小结 1．基因工程的内容包括①基因操作的工具：限制性内切酶、DNA连接酶、运载体；②基因操作的基本步骤：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达。 (1)限制性内切酶 生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。限制性内切酶是基因工程中最常用的切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶，其中一类可以识别特定的核苷酸序列，只在一定DNA序列上进行切割，而且在切割部位，一条链正向渎的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致，它们之间正好能互补配对，这样的切口叫做黏性末端，这类限制酶最常被使用。 (2)运载体 在基因工程操作中使用运载体的目的有两个：一足用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。现在所用的运载体主要有两类：一类是细菌的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于细菌DNA之外的环状DNA，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个，质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可以整合到细菌DNA中，随细菌DNA的复制而复制；另一类载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断地寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。 作为运载体必须具备三个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pHR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适用于多种限制酶切割的DNA插入；③有一定的标记基因，便于筛选，如大肠杆菌的pBR322质粒携带四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。 (3)基因工程操作的基本步骤 ①制备目的基因 即人们依据工程设计中所需要的DNA片段，采用超速离心法、噬菌体摄取法、分子杂交法、反转录法等方法获取。见下表： 过程 优点 缺点 直接分离法 (鸟枪法) 供体细胞中的DNADNA片段不同的受体细胞→扩增含目的基因细胞目的基因 操作简便 工作量大，有盲目性，目的基因含有不表达的内含子。 人工合成基因 反转录法 mRNA单链DNA双链DNA 专一性强、目的基因中不含内含子 操作过程复杂，mRNA存在时间短，技术要求高。 据已知的氨基酸序列合成 据推测出的核苷酸序列，通过化学方法合成 专一性强，目的基因中不含了含子，可合成自然界不存在的基因 目前，未知核苷酸序列的基因不能合成 ②体外重组DNA 外源DNA很难直接进入受体细胞，即使进入也会受到细胞内限制性内切酶的作用而分解。因而需要选择目的基因的载体(一般用细菌质粒和温和噬菌体)，使目的基因与载体DNA结合起来形成杂合子。 ③进行基转转移 将重组DNA杂合子向选定的生物受体细胞中转移，让重组DNA杂合子在受体细胞中自主复制并得以表达。 ④筛选 把转化的和没有转化的受体细胞区分开。在转化的受体细胞中，外源DNA所携带的遗传信息得到了表达，受体细胞就有了新的性状，达到了基因工程的预期目的。 2．基因工程技术的应用 (1)转基因生物 通过转基因技术把某种生物的基因或人工合成的基因转移到另一生物体内，从而培育出对人类有利的生物新品种。如我国科学家1989年将人的生长激素基因导入鲤鱼的受精卵中，培育成了转基因鲤鱼；1995年我国科学家将某种细菌的抗虫基因导入棉花，培育出了抗虫棉；1999年我国上海诞生了转基因牛，其牛奶中含有大量人体蛋白，可以治病。 (2)转基因药物 自从美国1977年第一次用改造的大肠杆菌生产出有活性的人的生长激素释放抑制素以来，基因工程技术已经成功地应用于生物治疗药物的研制。现已研制成功的基因工程药物有几十种，如已上市的人的生长激素、胰岛素、干扰索、尿激酶原、超氧化物歧化酶等。 (3)基因治疗将外源基因通过基因转移技术，将其插入病人适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。1990年美同国立卫生研究院的一个研究小组对一个四岁的患腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的女孩进行基因治疗。他们将正常ADA基因利用反转录病毒载体导入女孩淋巴细胞内，体外培养后回输入她体内，实验获得圆满成功。这是人类历史上第一个成功的基因治疗临床实验。1991年我国首例基因治疗血友病B获得成功。 (4)人类基因组计划 人类基因组计划是通过国际间科学家联合探测人类染色体组所含DNA分子中携带的全部遗传信息，即基因中碱基对序列，搞清它们在染色体