分光光度法测定DNA的浓度和纯度.docVIP

分光光度法测定DNA的浓度和纯度【目的要求】：了解：分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理； 掌握：分光光度法测定DNA浓度和纯度的技术方法；熟悉：分光光度法测定DNA浓度和纯度的实验操作步骤和注意事项。 【实验原理】：前面提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连接及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求，因此要测定DNA的浓度和纯度。测定DNA的方法通常有：紫外分光光度法；琼脂糖凝胶电泳法（也叫荧光光度法）（1）紫外分光光度法：组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250～270nm之间，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。（2）琼脂糖凝胶电泳法（荧光光度法）：对于很稀的核酸溶液，可以用琼脂糖凝胶电泳法。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的DNA。该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。 【仪器与试剂】：主要仪器：紫外分光光度计、石英杯、离心管、微量移液器；主要试剂：实验1提取的质粒样品、纯水。 【重要实验步骤和教学设计】：吸取5μL DNA样品或4μL RNA样品，加水至1ml混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中。如果样品很少，可以用0.5ml的比色杯，上述核酸样品与水的用量缩小一半。先用1ml水对分光光度计校正为零点。在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品的浓度我OD260 × 核酸稀释倍数 × 50/1000；RNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 40/1000；浓度单位为μg/μL。按步骤1的稀释方式，DNA或RNA的浓度（μg/μL）均为OD260的10倍；如OD260为0.1，则样品的浓度就为1μg/μL DNA或RNA。这样稀释倍数非常便于计算。若为DNA样品，OD260/OD280比值大于1.8，说明仍存在RNA，可以考虑用RNA酶处理样品；小于1.6，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，用乙醚抽提后，以乙醇沉淀纯化DNA。RNA样品OD260/OD280比值小于2，也应该考虑再用酚/氯仿抽提。 【实验注意事项】：使用石英杯时要注意拿取方法，不要直接拿透光的那两个侧面；测量前要调零，测量不同样品时要冲洗石英杯；正确开、关紫外分光光度计。 【思考题】：实验得出的数据是否合理？为什么？如果实验测得A260/A280＝1.8，是否能说明提取的DNA样品非常纯净？为什么？