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DNA测序技术的发展历史与最新进展 主讲人：邓媛媛 李洋 在2002年4月，美国《科学》杂志 ，登载了一篇长达14页的论文尤其引人注目———《水稻（籼稻）基因组的工作框架序列图》。 2004年12月，水稻基因组“精细图”全部完成 2004年12月10日，中国科学家在世界上率先完成的家蚕基因组“框架图”及基因组生物学分析成果在世界科学类权威的学术期刊——《Science》杂志上发表。 2009年12月13日，Nature杂志刊登了由深圳华大基因研究院领衔完成的大熊猫基因测序。 为什么要进行DNA测序？ DNA测序技术对象的发展 自20世纪70年代DNA序列分析技术发明以来，人类对基因和基因组结构的研究和探索就没有停止过。 1977年测定了噬菌体X174基因组全部核苷酸序列。 目前，已分析完成了大批生物的全部基因组序列，包括噬菌体、病毒、细菌、酵母、多细胞真核生物、小鼠和人类。 2001年初完成的人类基因组计划使基因组研究达到了高潮，是人类真正认识和自我改造的开端。 第一代DNA测序技术 成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。 ●1977年Sanger发明了双脱氧链终止法。 ●同一时期, Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。 ● 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。 这些技术统称为第一代DNA测序技术。 一，双脱氧链终止法 原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种dNTP 存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸( ddNTP) ,因为双脱氧核苷没有3′ -OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3′端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3′端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 二，化学降解法 在该方法中,一个末端被放射性标记的DNA片段在5组互相独立的化学反应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。生成5组放射性标记的分子,每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA片段上的位置。最后,各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 三，荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Sanger原理，用四种不同的荧光混合物分别标记四种反应的产物，用四种反应物混合在一起进行电泳，在激光的激发下四种带有不同荧光染料标记物的ddNTP可以在同一反应管种进终止测序反应，并于变性的聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测。当带有某种荧光素标记的DNA片段电泳到激光探头的检测范围时，激光所激发的荧光信号被探测器接受，经计算机分析数据，自动排列出DNA序列。 第一代测序法的比较 第二代DNA测序技术 · 罗氏454 公司的GS FLX测序平台 5.一个磁珠＝一条读长：携带DNA的捕获磁珠随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。 一、GS FLX测序技术的优点 GS FLX系统的测序也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将优点引物上每一个dNTP 的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳； 特点：分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化。 Solexa测序技术路线： Solexa测序技术的特点 ①通量高。目前一台机器在两周内最高可产出360G 的数据; ②准确率高。≥98. 5% ，同时也有效地解决了多