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H/D交换结合液质联用技术在代谢物鉴定中的应用 * * The Application of Hydrogen/deuterium Exchange Method Combined with LC-MS/MS in Metabolite Identification 氢原子(H，氕)，含有一个正价的质子与一个负价的电子。原子量：1 Da。自然丰度：99.985%. 氘原子(D)，氢的稳定同位素，也称重氢。它的原子核由一颗质子和一颗中子组成，外层有一个电子。原子量：2 Da。自然丰度：0.015% . H/D 交换的原理 H/D 交换的原理 含有可交换氢（exchangeable hydrogen atom）的化合物可以发生H/D交换，可以通过交换前后质量数的变化来判断结构中活性氢的个数。 可交换氢（exchangeable hydrogen atom）又称作活性氢（active hydrogen atom ）或酸性氢（acidic hydrogen atom ），通常是指与杂原子（O, N, S）相连的氢原子。常见的含活性氢的基团见下表： * Liu, D. Q., L. Wu, et al. (2007). On-line H/D exchange LC-MS strategy for structural elucidation of pharmaceutical impurities. J Pharm Biomed Anal 44(2): 320-329. 一些与活性亚甲基或次甲基（特别是与强吸电子基团或原子相连时）上的碳原子相连的氢可以表现出较强的酸性，亦可发生H/D交换。 形成分子内氢键的可交换氢只能进行部分交换。 H/D 交换的原理 当化合物存在于氘代溶剂（如：D2O，CH3OD）中时，由于体系中可交换的氢 –氘原子中绝大多数为氘，此时，化合物中的可交换氢可被氘充分取代。 R-XH + D2O → R-XD + DOH （R：有机分子部分结构；X：N，O，S；H：氢；D：氘） 由于氘比氢质量数多1 Da，当n个氢被氘交换掉时，化合物的分子量就增加n Da。 质谱检测时，若形成单电荷离子，正离子模式下，以H2O为流动相溶剂成分，形成分子离子峰[MH+H]+，以D2O为流动相溶剂成分，形成[MD+D]+，m/z 值增加(n+1) Da；负离子模式下，以H2O为流动相溶剂成分，形成分子离子峰[MH-H]-，以D2O为流动相溶剂成分，形成[MD-D]-，m/z 值增加(n-1) Da。 * Liu, D. Q., L. Wu, et al. (2007). On-line H/D exchange LC-MS strategy for structural elucidation of pharmaceutical impurities. J Pharm Biomed Anal 44(2): 320-329. H/D 交换的应用 核磁共振技术（NMR spectroscopy） 质谱技术（Mass spectrometry） 代谢物鉴别，杂质鉴别 区分S，N氧化物与C-羟化物。 蛋白质结构分析； 蛋白质分别用H2O和D2O进行前处理，测定HSQC 谱图，由于蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过检测交换速率差别确定空间结构信息 。 质谱裂解规律研究 蛋白质结构分析 H/D交换与质谱结合的操作方式有很多种，比如： 将样品用氘代试剂溶解，用针泵直接注入质谱分析( syringe pump )； 采用流动注射的方式，用氘代溶剂作流动相，在不接色谱柱的情况下，将样品直接进样分析(flow injection)； 液质联用系统，接入色谱柱，采用柱后接三通注入氘代溶剂的方式进行H/D交换； 液质联用系统，接入色谱柱，采用氘代溶剂作为流动相进行H/D交换 (水相用D2O，有机相用乙腈或氘代甲醇) 。 交换效率高，对条件的依赖性小。 Ohashi, N., S. Furuuchi, et al. (1998). Usefulness of the hydrogen--deuterium exchange method in the study of drug metabolism using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal 18(3): 325-334. （e）ESI (flow injection); (f) ESI (syringe pump); (g) ESI (HPLC). 实例——D-IPCPA的代谢产物鉴定 元素组成：C21