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人类 K-ras 基因突变检测试剂盒（ PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通 用 名：人类 K-ras 基因突变检测试剂盒（ PCR-熔解曲线法） 英 文 名： Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20 测试 / 盒 【预期用途】 K-ras基因位于 12号染色体短臂上 ，是重要的癌基因之一，编码一种 21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号 传递，主要包括 PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK 信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的 热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。 K-ras基因第 12和 13密码子发生突变，将导致 kras蛋白变异并 处于持续激活状态， 使药物失效。 。据中国 2010版《肿瘤学临床实践指南》 ，在一项包含 101例肺腺癌亚型细支气 管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。 K-ras 突变者无一例缓解（ 0/18 ），而 无 K-ras 突变者则有 20例缓解（ 20/62 ，32%），差别有统计学意义（ P 0.01 ）。因此，指南建议，非小细胞肺 癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行 K-ras 基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组 DNA 为检测样本，用于检测肿瘤组织 K-ras 基因第 12，13 密码子的 12 种体细胞突变（表 1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个 体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 表 1 本品可检测的 K-ras 基因突变 K-ras 基因 12 密码子突变 K-ras 基因 13 密码子突变 Gly12Ser GGT AGT Gly13Ser GGC AGC Gly12Arg GGT CGT Gly13Arg GGC CGC Gly12Cys GGT TGT Gly13Cys GGC TGC Gly12Asp GGT GAT Gly13Asp GGC GAC Gly12Ala GGT GCT Gly13Ala GGC GCC Gly12Val GGT GTT Gly13Val GGC GTC 【检验原理】 本试剂盒基于实时 PCR 平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测 DNA 样品中 K-ras 基因 12， 13 密码子是否存在突变。用一对 K-ras 基因特异引物，该引物可扩增 12 种突变型和野生型的 K-ras 目标序列，利用标记了 FAM 荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增，提高突变基因 的检测灵敏度，另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物的分析，荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬 灭基团相互接近而被淬灭，不发荧光，杂交状态时，二者相互离开而产生荧光。该荧光探针分别与突变基因和 野生型基因的杂交产物在熔解曲线分析时，表现为熔解曲线导数图中出现不同位置的峰，熔解峰对应的位置即 为熔解温度（ Tm 值），因野生峰的位置较突变峰位置大 3℃以上而得到区分，但各种突变峰因 Tm 值相差较小 而不能辨别。。 本品可稳定地检出野生型 10ng/ul 基因组背景下 1%含量的体细胞突变，其熔解曲线会出现双峰，其中突变 峰较野生