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第7章 高效液相色谱法 7.1 高效液相色谱法 7.1.1 特点: (1)高压 最高输送压力可达4.9×107 Pa,为了使流动相能迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压; (2)高速 例如,分离苯的羟基化合物七个组分,只需要1 min就可完成。载液流速一般可达1~10 mL·min-1; (3)高效 色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱,每米塔板数可达几万到几十万; (4)高灵敏度 HPLC广泛采用高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。如紫外检测器的最小检测量可达纳克数量级(10-9 g);荧光检测器的灵敏度可达10-11 g。 7.1.2 液相色谱与气相色谱的比较 1 基本概念 液相色谱所用基本概念: 保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。 液相色谱所用基本理论: 塔板理论与速率方程式也与气相色谱基本一致。 2 主要区别 (1) 应用范围不同 液相色谱不受样品挥发度和热稳定性的限制,它非常适合于分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析; (2) 液相色谱能完成难度较高的分离工作 ; (3) 由于液体的扩散性比气体的小105倍,因此,溶质在液相中的传质速率慢,柱外效应就显得特别重要;而在气相色谱中,柱外区域扩张可以忽略不计。 (4) 液相色谱中制备样品简单,回收样品也比较容易,而且回收是定量的,适合于大量制备。 (5) 液相色谱尚缺乏通用的检测器,仪器比较复杂,价格昂贵。 7.2 高效液相色谱分类及分离原理 7.2.1 高效液相色谱分类 分离机制不同,液相色谱可分为: 7.2.2 各类高效液相色谱工作原理 1 液-液分配色谱 液液色谱又称液液分配色谱。 流动相:液体 固定相:将另一种液体涂渍在很细的惰性 载体或硅胶上。 当被分离样品进入色谱柱后,组分分子在两相间呈下列平衡: 式中Xm和Xs分别表示流动相中和固定相中的组分分子。 正相分配色谱和反相分配色谱 正相分配色谱: 以极性物质作固定相,非极性溶剂作流动相。它适合于分离极性化合物; 反相分配色谱: 用非极性物质作固定相,极性溶剂为流动相。它适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。 2 液-固色谱法 液固色谱法又称吸附色谱法。 (1)流动相和固定相 流动相为液体,固定相为固体吸附剂。 (2)作用机制 式中Xm和Xa分别表示在流动相中和被吸附的溶质分子,Sm代表被吸附在表面上的溶剂分子,Sm表示在流动相中的溶剂分子。n是被吸附的溶剂分子数。 3离子交换色谱法 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography, IEC)以离子交换树脂作为固定相,树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时,组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换。根据组分离子对树脂亲合力的不同而得到分离。 阳离子交换: 阴离子交换: 式中“──”表示在固定相上,Kxy和KZM是交换反应的平衡常数,Z+和X-代表被分析的组分离子。M+和Y-表示树脂上可交换的离子团。 4 离子对色谱法 将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合生成疏水型离子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。 (1) 分离原理 流动相中待分离的有机离子X+(或X-)与固定相或流动相中带相反电荷的对离子Y-结合,形成离子对化合物X+Y-,而后在两相中进行分配: (2)正相离子对色谱法和反相离子对色谱法: 正相离子对色谱法: 用极性物质作固定相,极性非溶剂为流动相。 反相离子对色谱法: 采用非极性疏水固定相,含有对离子Y-的极性溶剂如甲醇-水,或乙睛-水作流动相。最常用。 5 离子色谱法 通过分离柱后的样品再经过抑制柱,使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相,从而用电导检测器可直接检测各种离子的含
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