蛋白质与氨基酸的测定.pptVIP

三、双缩脲法 1原理 在碱性条件下，铜离子和多肽(至少有两个肽键，如双缩脲、多肽和所有的蛋白质)生成的复合物呈紫红色，吸收波长为560nm，比色所得的吸光度值和样品中蛋白质的含量成正比。 2测定方法 (1)5mL双缩脲试剂和1mL蛋白质溶液(1~10mg蛋白质／mL)混匀。试剂包括硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠以及稳定在碱性溶液中的铜离子； (2)混合液在室温下放置15min或30min，然后在560nm处比色，读取吸光度值，并扣去空白； (3)如果反应液不澄清，在测定吸光度前可过滤或离心； (4)用牛血清白蛋白(BSA)建立蛋白质浓度与吸光度的标准曲线。 双缩脲法优点 ①该方法比凯氏定氮法费用低，速度快(可在不到30min的时间内完成)，是分析蛋白质最简单的方法； ②比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离； ③几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应； ④不需要测定非多肽或非蛋白质来源的氮。 缺点 ①不如福林酚法灵敏，分析时至少需要2~4mg蛋白质； ②如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加； ③高浓度的胺盐会干扰反应； ④不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，如明胶的双缩脲反应产生红紫色； ⑤如果有高浓度的脂或碳水化合物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色；