第六章基因克隆的载体与受体.pptVIP

质粒载体;载体 载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载工具。DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。 载体的条件：　①.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源DNA一起复制。　②.具多克隆位点，即有多种限制酶的切点；且切点不存在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记性状的表现。　③.至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基因。　④.易从宿主细胞中回收克隆。;第一节 质粒载体 ;（1）分子小： ;（4）质粒的空间构型：;③ 线形DNA （ linear ，lDNA）;（5）质粒空间构型与电泳速率;二、质粒的类型;除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。;2. 非接合型质粒：;三、质粒的复制类型;氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）;② 遗传标记;经典的大肠杆菌质粒载体;6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。;;当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。;另：pUC18质粒具有以下特点：　　①. 分子量小，可接受较大外源片段；　　②. 拷贝数多，500个／细胞；　　③. 克隆位点的酶切位点多，克隆方便；　　④. 具有用于检测重组质粒的选择标记 （如α–互补的显色表型） 。 ;③ lacZ的?肽互补;2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15）;pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，从而能分解X-gal，产生蓝色物质。;4）?互补的插入失活;④ IPTG的诱导作用;通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;;;第二节 噬菌体载体 ; 双链噬菌体为λ类噬菌体，单链丝状噬菌体有M13、f1、fd噬菌体。 重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有λ类噬菌体和M13噬菌体。 λ类噬菌体 :一种是插入型载体，只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，另一种是替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 　　 在基因克隆中二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。 ; M13噬菌体载体 　　M13噬菌体是基因组为一长度6.4kb的且彼此同源性很高的单链闭环DNA分子。该类噬菌体作为克隆载体，主要用于克隆单链DNA。;第三节 大分子DNA克隆载体;细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，命名为pBACs，其装载量范围在50 - 300 kb之间。 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster） 构建动植物基因文库;大肠杆菌;枯草杆菌;链霉菌;酵母菌;植物细胞（拟南芥、烟叶）