实验八 酶促反应的影响因素.docVIP

实验八 酶促反应的影响因素 一、目的要求 1．了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。 2．学习检定温度、pH、激活剂、抑制剂影响酶促反应速度的方法。 ? 二、实验原理 在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、 pH有密切关系，通常各种酶只有在一定的温度、pH范围内才表现它的活性，一种酶表现其活性最高时的温度、 pH值称为该酶的最适温度、最适pH。 在酶促反应中， 酶的激活剂和抑制剂可加速或抑制酶的活性，如氯化钠在低浓度时为唾液淀粉酶的激活剂，而硫酸铜则是它的抑制剂。 本实验利用淀粉水解过程中不同阶段的产物与碘有不同的颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中各种因素对其活性的影响。 淀粉（遇碘呈蓝色）→紫色糊精(遇碘呈紫色)→红色糊精(遇碘呈红色)→无色糊精 (遇碘不呈色)→麦芽糖(遇碘不呈色)→葡萄糖(遇碘不呈色)。 所以淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断，以此反映淀粉酶的活性，由此检定温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应的影响。 ? 三、实验器材 试管和试管架、恒温水浴、冰浴、吸量管（1 mL6支、2 mL4支、5 mL4支）、滴管、量筒、玻棒、白瓷板、秒表、烧杯、棕色瓶。 ? 四、实验试剂 ? 1．新鲜唾液稀释液(唾液淀粉酶液)：每位同学进实验室自己制备，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，0.5 min后使其流入量筒并稀释至200倍(稀释倍数可因人而异)混匀备用。 2．1%淀粉溶液A(含0.3%NaCl)：将1 g可溶性淀粉及0.3 g氯化钠混悬于5 mL蒸馏水中，搅动后，缓慢倒入沸腾的60 mL蒸馏水中，搅动煮沸1 min，冷却至室温，加水至100 mL,置冰箱中保存。 3．1%淀粉溶液B(不含NaCl) 4．碘液：称取2 g碘化钾溶于5 mL蒸馏水中，再加入1 g碘，待碘完全溶解后，加蒸馏水295 mL，混匀贮于棕色瓶中。 5．1%NaCl溶液 6．1%CuSO4溶液 7．缓冲溶液系统按下表混合配制。 pH 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液体积/ mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液体积/ mL 5.0 5.8 6.8 8.0 5.15 6.05 7.72 9.72 4.85 3.95 2.28 0.28 ? 五、操作步骤 1．温度对酶促反应的影响 取3支试管编号，按下表进行操作： 试管号 淀粉酶液体积/ mL 酶液处理温度/ ℃，5 min pH6.8缓冲溶液体积/ mL 1%淀粉溶液A体积/ mL 反应温度/ ℃，10 min 观察结果 1 2 3 1 1 1 0 37～40 70左右 2 2 2 1 1 1 0 37～40 70左右 ? 上述各管在不同的温度下保温反应10 min后，立即取出，流水冷却3 min， 向各管分别加入碘液1滴。仔细观察各试管溶液的颜色并记录，说明温度对酶活性的影响，确定最适温度。 2．pH对酶促反应的影响 取1支试管,加入1%淀粉溶液(A)2 mL、pH6.8缓冲溶液3 mL、淀粉酶液2 mL，摇匀后，向试管内插入一支玻棒,置37 ℃水浴保温。每隔1 min用玻棒从试管中取出1滴混合液于白瓷板上，随即加入碘液1滴，检查淀粉水解程度。待混合液遇碘不变色时，从水浴中取出试管，立即加入碘液1滴，摇匀后，观察溶液的颜色，再次确认水解程度。记录从加入酶液到加入碘液的时间，此时间称为保温时间。若保温时间太短（2～3 min），说明酶液活力太高，应酌情稀释酶液；若保温时间太长（15 min以上），说明酶液活力太低，应酌情减少稀释倍数，保温时间最好在8～15 min。然后进行如下操作： 取4支试管编号，按下表操作： 试管号 缓冲溶液体积/ mL 1%淀粉溶液A体积/ mL 淀粉酶液体积/ mL（每隔1 min逐管加入） 观察 结果 pH 5.0 ? pH 5.8 ? pH 6.8 pH 8.0 1 2 3 4 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 2 2 2 2 2 2 2 2 ? ? ? ? ? 将上述各管溶液混匀后，再以1 min间隔依次将4支试管置于37 ℃水浴中保温。达保温时间后，依次将各管迅速取出，并立即加入碘液1滴。观察各试管溶液的颜色并记录。分析pH对酶促反应的影响，确定最适pH。 3．激活剂、抑制剂对酶促反应的影响 取3支试管编号，按下表加入各试剂（体积单位：mL）： 试管号 1%淀粉溶液B 1%NaCl溶液 1%CuSO4溶液 蒸馏水 淀粉酶液 观察结果 1 2 3 2 2 2 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 ? ? 将上述各管溶液混匀后，向1号试管内插入一支玻棒，3支试管同置于37 ℃水浴保温1 min左右，用玻棒从1号试管