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实验十：细胞原代培养 【实验目的】 以小鼠胎儿为材料，学习细胞原代培养中常用的组织块培养法和消化培养法；掌握组织取材、剪切、细胞分离、混匀、接种和器械使用等操作要领；掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，并为下一步细胞传代培养、细胞纯化和冷冻保存等实验提供材料。 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 【仪器、材料与试剂】 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：胎鼠或新生鼠 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒 【实验步骤】 （一）胰酶消化法 1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。 【实验步骤】 4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。?? 上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。 （二）组织块直接培养法 自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 【注意事项】 1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 【实验报告】 1.比较组织块培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和优缺点。 2.描述组织块消化后，离心管中显示的最佳实验现象。 3.观察和记录原代细胞的形态、培养细胞的贴壁时间、增殖时间、完全汇合时间。 * 【实验原理】 培养箱 【仪器、材料与试剂】 【实验步骤】 【实验步骤】 1.组织小块消化后，出现上清液清亮，液体中有线形絮状物，分析产生这种情况的原因，采取何种补救措施仍可获得较多的细胞？ 2.观察原代培养细胞中的细胞类型，并根据以往的知识初步分析哪类细胞属于成纤维样细胞，哪类细胞属于上皮样细胞。 【思考题】 *