急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究_0.docVIP

急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究 作者:任海全，唐天华，毕可红，张玉昆，赵良玉，郭桂月，刘秀兰，姜枫勤，刘传芳，彭军，田志刚 ［摘要］ 目的 检测完全缓解后急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病(MRD)，同时 分析 其对预后判断的指导价值。 方法 建立逆转录PCR(RT/PCR)用以检测APL患者PML/RARα。结果 RT-PCR方法敏感而可重复。 治疗 前APL患者的RT-PCR阳性率为92.8%(39/42)，而维甲酸或化疗诱导完全缓解后MRD阳性率为56.7%(21/37)。另外，MRD阳性与缓解后APL患者的复发有关，并可以作为缓解后预测APL患者复发的指标。同时有助于指导临床上采取巩固治疗而防止复发。结论 RT-PCR能够检测APL患者的MRD和作为预测复发的指标。 ［关键词］ 急性早幼粒细胞白血病；微小残留病；RT/PCR 白血病患者完全缓解（CR）后的微小残留病（MRD）已被证实与复发有关［1］。MRD的检测也成为指导缓解后进一步化疗的重要指标［2］。在 目前 血液病的 应用 实践中，MRD检测的最好例子是骨髓移植后RT-PCR法检测慢性粒细胞白血病（CML）的BCR-ABL融合基因［3］。 急性早幼粒细胞性白血病（APL）以特异的染色体t（15;17）（q22;q21）易位为特征［4］。最近，许多实验室发现t（15;17）易位后，通过15染色体上的PML基因和17染色体上的RARα基因并列而导致融合基因PML/RARα形成［5］。根据PML断裂点的位置不同，可以产生2个主要的PML/RARα异构体。断裂点位于PML内含子3或4（bcr3），则PML外显子3（P3）和RARα外显子3（r3）之间形成短（S）型融合mRNA产物，而断裂点位于PML内含子6（bcr1）或下游，PML内含子6（P6）和RARα外显子（r3）形成长（L）型融合体［6，7］。RT-PCR法的建立正是依赖于断裂点的位置而设计适当寡核苷酸引物，继而扩增PML/RARαmRNA异构体［8］。另外，RT-PCR的高度敏感性使得MRD的检测成为可能，并可在APL患者临床缓解期时早期预测白血病的复发。 1 资料与方法 1.1 病例选择 本 研究 中的42例患者均为1993～2000年发病，男26例，女16例，年龄12～72岁，根据FAB标准［9］诊断为APL。全部病例均经全反式维甲酸（ATRA）治疗［30～60mg/（m2·d）］诱导缓解。巩固化疗方案为标准的HOAP或DA方案。巩固治疗后处于缓解期的患者采用全国维甲酸协作治疗组建议的ATRA与化疗联合治疗方案维持治疗［10］。骨髓单个核细胞用Ficoll分离并保存于液氮中。 1.2 RNA提取 10ml淋巴细胞分离液加于试管中，然后2ml骨髓细胞缓慢加入试管中，离心4000r/min 20min。取单个核细胞移入另一试管中，再用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法抽提RNAs［11］。提取时注意避免样品间的交叉污染。 1.3 筑巢式RT-PCR检测 APL的PML/RARα检测方法：8个寡核苷酸引物用于逆转录、扩增，检测其长或短型异构体。 逆转录引物：A 5-TGGATGCTGCGGCGGAAGAAGCCCTTGCAG-3 PML/RARα引物：B 5-GTCATAGGAAGTGAGGTCTTC-3C5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3 D5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3E5-AACAGCAACCACGTGGCCAG-3F5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3 G5-AGCCTGAGGACTTGTCCTGA-3H5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3 正常RARα转录引物：I5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCT-3 J5-AAAGCAAGGCTTGTAGATGC-3 K5-GACCACTCTCCAGCACCA-3L5-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAACT-3 RT-PCR方法与步骤按照早期报道的方法进行［12］。 1.4 PCR产物分析 取10μl第2轮PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭1μg/ml染色，照相。并移至尼龙膜上，用5末端寡核苷酸探针（H）杂交，放射自显影30min，拍片。 1.5 统计学方法 采用t检验。 2 结果 2.1 PCR产物的结果及其敏感度 PML/RARα的L、S异构型（见图1）。RT-PCR的敏感度为2.5×10-6。 图1 PML/RARα类型 2.2 RT-PCR阳性百分率 用全反式维甲酸治疗前APL患者PML/RARα的检测，34例为L型阳性，5例为S型阳性。L型、S型或2型的总阳性百分率分