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愈风颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡及bcl-2,bax表达影响的实验研究 【摘要】 　　目的研究愈风颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤模型脑神经细胞凋亡及bcl-2,bax表达的影响。方法将脑缺血再灌注损伤大鼠分为3组：中药组，西药组及模型组，另设正常组作对照。观察各组大鼠脑组织TUNEL及bcl-2,bax表达的变化。结果模型组大鼠脑组织TUNEL阳性数，bcl-2，bax阳性细胞数显著高于正常组，bcl-2/bax比值显著低于正常组（均P0.01）；中药组及西药组脑组织TUNEL阳性数，bax阳性细胞数显著低于模型组，bcl-2阳性细胞数及bcl-2/bax比值显著高于模型组(均P0.01)。结论愈风颗粒有明显的抗凋亡作用，其作用机制可能与下调促凋亡基因bax水平，上调抗凋亡基因bcl-2水平，提高bcl-2/bax比值有关。 【关键词】 愈风颗粒； bcl-2； bax； 细胞凋亡 愈风颗粒为自拟方药，有通腑泄热、凉血解毒之功，主要用于急性期脑梗塞的 治疗 。为探讨其作用机制，为临床提供依据，本实验研究愈风颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡及bcl-2,bax表达的影响。 　　 1 材料与方法 　　1.1 动物老年Wistar大鼠40只，清洁级，雌雄各半，体质量（300±20）g，华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，动物字号：TJLA-2003-111。 　　1.2 药物与试剂愈风颗粒，以蒸馏水稀释为50%的水溶液（每毫升溶液含生药0.5 g）；尼莫地平片，以蒸馏水稀释为1%的水溶液（每毫升溶液含生药1 mg）；生理盐水。原位细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL），大鼠bcl-2免疫组化染色试剂盒，bax免疫组化染色试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司生产。 　　1.3 分组大鼠随机分为4组：正常对照组（简称正常组）、造模对照组（简称模型组）、尼莫地平组（简称西药组）、愈风颗粒组（简称中药组），每组10只。 　　1.4 造模按 文献 ［1］方法造大鼠脑缺血再灌注模型。大鼠麻醉、固定，切开颈部分离出双侧颈总动脉，用小动脉夹夹闭双侧颈总动脉30 min，松开双侧颈总动脉夹造成再灌注60 min模型。正常组麻醉后颈部切开分离双侧颈总动脉，不夹闭。 　　1.5 处理造模前30 min中药组给予愈风颗粒水溶液按5 g/kg体质量灌胃；西药组给予1%尼莫地平水溶液按10mg/kg体质量灌胃；模型组及正常组给予生理盐水按10 ml/kg体质量灌胃。每只大鼠灌胃1次。 　　1.6 指标测定 　　造模24 h后断头处死动物，快速取脑在冰皿上自嗅结节前缘4 mm处做冠状切片，厚度4 mm，立即放入4%多聚甲醛固定12 h，脱水，浸蜡，包埋后连续切片，厚度5 μm。脑组织原位细胞凋亡检测（TUNEL），bcl-2,bax阳性细胞的检测均由武汉博士德生物工程有限公司完成。 　　1.7 统计学处理各组切片均用显微镜观察，以高倍镜（40×10）下观察5个视野，观察每个高倍视野下平均TUNEL，bcl-2,bax阳性细胞数。计数资料以±s表示，做F检验及Q检验，以P0.05为有显著性差异。 　 　2 结果 　　2.1 各组大鼠脑组织凋亡（TUNEL）阳性细胞数及百分率的比较见表1。由表1可见，模型组大鼠脑组织凋亡阳性细胞数及百分率显著高于正常组（均P0.01）；中药组及西药组大鼠脑组织凋亡阳性细胞数及百分率显著低于模型组（均P0.01），中药组与西药组间大鼠脑组织凋亡阳性细胞数及百分率无显著性差异（P0.05）。表1 各组大鼠脑组织凋亡（TUNEL）阳性细胞数及百分率的比较（略） 　　2.2 各组大鼠bcl-2,bax阳性细胞数及bcl-2/bax比值的比较见表2。从表2可见，模型组大鼠脑组织bax，bcl-2阳性细胞数显著高于正常组，bcl-2/bax比值显著低于正常组（均P0.01）；中药组及西药组大鼠脑组织bax阳性细胞数显著低于模型组，bcl-2阳性细胞数及bcl-2/bax比值显著高于模型组（均P0.01）；中药大剂量组大鼠脑组织bax、bcl-2阳性细胞数与西药组间无显著性差异（P0.05）。表2 各组大鼠bcl-2,bax阳性细胞数及bcl-2/bax比值的比较（略） 　 　3 讨论 　　愈风颗粒为自拟方药，由生大黄、水牛角等药组成，有通腑泄热、凉血解毒之功，主要用于急性期脑梗塞患者的 治疗 。近年来,越来越多的实验证明,脑缺血与细胞凋亡之间存在着密切的关系。郝氏等［2］研究发现脑细胞的凋亡于缺血再灌注后6 h开始增加，于24 h达高峰，于36 h有下降，凋亡细胞以缺血半暗带明显。说明缺血再灌注容易引起脑神经细胞的凋亡，是脑梗死脑损伤的机理之一。本研究结果表明，模型组大鼠脑组织TUNEL阳性数显著高于正常