分子生物学综合实验报告.docxVIP

综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。2.学习碱裂解法提取质粒的原理。3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。PCR循环由三个步骤组成：变性 、退火、延伸 。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。三．实验准备1.实验材料：含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基2.实验试剂：Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液， T4 DNA连接酶， 0.1mol/L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：0.03M 柠檬酸钠，0.3M NaCl， 0.2M EDTA， 变性液：0.5N NaOH，1.5M NaCl，中和度：0.5M Tris-HCl、pH7.4、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 0.02% (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M Tris-HCl，0.15 M NaCl. pH=7.5，封闭液：1%Blocking Reagent/ 0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl，显色缓冲液：0.1mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH=9.5， TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0，2%，LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的0.2%），溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，TE缓冲液，无水乙醇和70%乙醇。3.实验仪器：微量移液器，1.5ml离心管，DNA吸附柱，DNA收集管，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，恒温水浴箱，PCR仪，培养皿，超净工作台，硝酸纤维素膜或尼龙膜。四．试验方法1.质粒的提取：①培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接