核酸分子杂交技术2010-11-04.pptVIP

概念：用同位素或其他化学方法标记的与待测靶核苷酸序列互补杂交的核酸片段（DNA或RNA ）。 用途：检测待检核酸样品中的特定基因序列。 (DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA) 要求：特异性，来源方便 hybridization DNA:DNA 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C DNA:RNA 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U RNA:RNA 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C （一）基因组DNA探针 1.来源：这类探针来源于某种生物的基因组 多为某一基因的全部或部分序列。 2.制备方法: （1）基因克隆的方法 （2）聚合酶链反应(PCR) 3.特点: （1）多克隆在载体中的DNA片段，可以无限 繁殖，取之不尽。 （2）相对RNA而言，DNA探针不易降解，标 记方法也较成熟。 （二）cDNA探针 1.制备: cDNA文库中筛选。 2.特点: 不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。 （三）RNA探针 （四） 寡核苷酸探针 特点 : ◆ 根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点 ； ◆ 大多数长度一般为20～50bp ； ◆ 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信 号较弱 特点 :◆ 灵敏度高，特异性高； ◆ 检出限：1~10ug ； ◆ 环境污染，半衰期短。 酶促法 1.缺口平移法（nick translation） 2．随机引物法 (random priming) 3．DNA探针的末端标记 （1）Klenow大片段的末端标记法 （2）多核苷酸激酶标记法（polynucleofide kinase，PNK) 制备特异性探针所需要的基本条件 1.被检基因结构清楚； 2.有明确的基因产物; 3.已知某一基因产物； 具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。 第三节 核酸分子杂交技术 一、Southern印迹杂交 基因表达产物的检测Western印迹法 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。 优点: 分辨率高(1~5ng);特异;简便;稳定 HRP显色原理 SDS及Western blotting SDSWestern blotting显色 Northern印迹杂交流程图 二、Northern印迹杂交 Southern杂交结果 Northern杂交结果 准备PAGE胶 样品的制备 加样 SDS(蛋白先定量) 蛋白质的电转移 抗体结合与显色检测 判断结果 实验流程: 聚丙烯酰胺凝胶分离 Western blot蛋白质转移 Western blot 显色反应 HRP * 严永敏 细胞与分子诊断系 yym@ujs.edu.cn 目 录 基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术 变性 在热、酸碱或变性剂作用下，DNA双螺旋的氢键断裂，解离为两条单链DNA的现象称为变性。 变性的特征 生物学活性丧失,增色效应 核酸的变性与复性 磷酸二酯键 DNA和RNA的一级结构 DNA解链曲线 增色效应(hyperchromic effect) 核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收急剧增加的现象。 Tm值 ：当紫外吸收变化达到最大变化的半数值时，此时所对应的温度称为熔解温度（Tm ）、变性温度或中点解链温度。 影响Tm值的因素 1.溶液的性质 2.DNA中碱基组成的影响 大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线 复性 复性：变性DNA分开的两股链在适当条件下重新生成双链结构的过程 退火（annealing）:热变性的DNA经缓慢冷却复性的过程。 淬火：热变性的DNA骤然冷却的过