几种超分辨率显微术原理及对比.pdf

各厂家超分辨技术  1、 莱卡公司采用的超分辨技术STED  2000 年，德国科学家StefanHell 开发了另一种超高分辨率显微技术， 其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少 点扩散函数的半高宽来提高分辨率．当特定的荧光分子被比激发波长 长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态．利用这个特性，Hell 等开发出了受激发射损耗显微技术 (stimulatedemissiondepletion,STED)．其基本的实现过程如图2 所示， 就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧 光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、 环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激 发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显 微镜的分辨率,原理见下图。    STED 成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过 程，因此在生命科学中应用更加广泛.                                2、 蔡司公司采用的超分辨技术PLAM  2002 年，Patterson 和Lippincott‐Schwartz 首次利用一种绿色荧光蛋白 (GFP)的变种(PA‐GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧 光蛋白PA‐GFP 在未激活之前不发光，用405nm 的激光激活一段时间 后才可以观察到 488nm 激光激发出来的绿色荧光．德国科学家 EricBetzig 敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这 种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006 年 9 月，Betzig 和Lippincott‐Schwartz 等首次在Science 上提出了光激活定 位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM) 的概念．其基 本原理是用 PA‐GFP 来标记蛋白质，通过调节405nm 激光器的能量， 低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子， 然后用 488nm 激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分 子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用 488nm 激光照射来漂 白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激 活出来．之后，分别用405nm 和488nm 激光来激活和漂白其他的荧 光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞 内所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一张图上，最 后得到了一种比传统光学显微镜至少高 10 倍以上分辨率的显微技术， 原理如下：    PLAM 通过定位细微结构乃至单分子，实现 20  nm  的横向分辨率和  50 nm 轴向分辨率。      大鼠少突胶质细胞 线粒体      3、 尼康公司采用的超分辨技术STROM 和SIM  STROM:   2006 年底，美国霍华德‐休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发 出来一种类似于PALM 的方法，可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨 率定位．他们发现，不同的波长可以控制化学荧光分子Cy5 在荧光激 发态和暗态之间切换，例如红色561nm 的激光可以激活Cy5 发射荧 光，同时长时间照射可以将Cy5 分子转换成暗态不发光．之后，用绿 色的488nm 激光照射Cy5 分子时，可以将其从暗态转换成荧光态， 而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3 与Cy5 之间的距离．因此， 当Cy3 和Cy5 交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发 射波长的特性．将Cy3 和Cy5 分子对胶联到特异