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概念 核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异质双链的过程, 即来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋，称为核酸分子杂交(hybridization)。具有灵敏度高、特异性强等优点。 主要用于特异DNA或RNA的定性、定量检测。 核酸探针核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 核酸探针的类型 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 4.1 膜上印迹杂交 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。 三、液相杂交技术 液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于杂交液中进行反应，然后分离杂交双链和未参加反应的标记探针，再进行检测。 4.反向斑点杂交(reverse dot hybridization)： 直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与之杂交，这样一次杂交反应就可以判断待测DNA是否含有这些探针的同源序列。 5.菌落或噬菌斑杂交(图7-13)。 二、核酸原位杂交 用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞或组织切片中核酸进行杂交检测的方法称为核酸原位杂交(nucleic acid hybridization in situ) 一般的原位杂交有两种类型：与胞内DNA的杂交和与RNA的杂交。 组织原位杂交简称原位杂交。原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。 原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） * * 核酸分子杂交 1 分子杂交的发展 核酸杂交技术基本上是从Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。 60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。 70年代末期到80年代早期，限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富，可获得大量的探针DNA。由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18～100个碱基的寡核苷酸探针。 应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因，大大提高了杂交水平和可信度。 目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组织病理学的研究、生物分类方面。 核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补。 分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与RNA(In situ)或RNA与DNA(Northern blot)的二条单链之间进行。 2 核酸分子杂交的基本原理 2.1 杂交的稳定性 Tm是核酸双链解链成单链过程中，其克原子消光系数? (P)值的增加达到最高值一半时的温度。 影响因素有： (1) 杂交链GC含量 (2)?杂交链愈长其Tm值愈高。 (3)?杂交双链的碱基错配程度。 (4)?溶液的离子强度越大，Tm值愈高。 变性剂可影响碱基堆积力和氢键的形成，可降低Tm值，常用甲酰胺、脲及二甲基亚砜等。用50%的甲酰胺大约可使杂交双链的Tm值降低30℃。 2.2 杂交动力学 杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局部双链，如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新解离，继续碰撞，一旦找到正确的互补区，两侧的序列迅速配对形成完整的双链分子，后一步反应是一个自发过程。 影响因素主要有： (1)????探针浓度、长度和复杂性 探针浓度越高，复性速度越快。 探针越长，扩散速度越慢，复杂性越高，配对难度越大。 (2)????离子强度 高离子强度溶液中，其正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分子的形成。 (3)????温度 通常杂交温度在低于Tm 20~25℃温度下进行。不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行。当含50%甲酰胺时，在42℃进行。 寡核苷酸探针一般在低于Tm值5℃~10℃下进行。 (4)????杂交促进剂 用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附DNA探针分子，使接触面积增大，有利于杂交反应。 (5)????? 杂交条件的严谨性 所谓严谨性(stringency)，是指杂交反应体