第二章第五-七节基因工程的技术和方法二.pptVIP

1. 表型特征进行筛选 a. 根据载体表型特征的筛选 抗药性标记插入失活法 Β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 b. 根据外源ＤＮＡ提供的遗传性状的筛选 c. 利用噬菌斑的形成 d. 利用遗传互补作用 抗药性标记插入失活法 Β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 蓝白筛选　载体（如pUC,pBS等）带有包括乳糖操纵子的调控序列和编码β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的基因序列。并在编码区中构建了多克隆位点，它不破坏读框，可使几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端．β-半乳糖苷酶基因在IPTG的诱导下产生肽段与宿主菌其余肽段结合成有活性的β-半乳糖苷酶 。此酶能使显色底物X-gal分解成蓝色化合物，从而使菌落发蓝。若有外源片段插入载体的多克隆位点，则使β-半乳糖苷酶基因失活，不能产生α肽，形成白色菌落。 2.物理筛选法 电泳检测法 Ｒ－环检测法： 　　 ４.ＰＣＲ技术进行鉴定 　４.１基本原理： 　PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 　１）模板DNA的变性：93℃左右，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 　　２）模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 　　３）引物的延伸：TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 　　４）重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 ６. 免疫化学检测法 a. 放射性抗体检测法 b. 免疫沉淀检测法 c. Western印迹分析法 ８.核酸分子杂交检测法 a.菌落印迹原位杂交 b.斑点印迹杂交 c.Southern印迹杂交 第六节 克隆基因与表达系统 一、基因工程的目的和主要工作 （一）基因工程的目的有: 1.生产基因工程的产品。 2.改良生物的性状, 对人来说是开展基因治疗。 （二）根据克隆基因和宿主细胞的不同,基因工程的工作可以分成: 1. 克隆真核基因在真核系统表达,如开展基因治疗 2.?克隆真核基因在原核系统表达,如生产基因工程的 产品。 3.?克隆原核基因在原核系统表达。 4.?克隆原核基因在真核系统表达。 由于人类赖以生存的生物类群与真核关系密切,而原核生物的繁殖优势是任何真核生物都无法比拟的,所以除了开展基因治疗外, 基因工程的主要工作是克隆真核基因在原核系统表达。 二.外源基因在原核生物中正确表达的基本条件? 启动子 Ｓ－Ｄ序列 起始密码子 终止子 转译后的修饰和加工 ?原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有: Lac(乳糖启动子) Trp(色氨酸启动子) Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) lPL (λ噬菌体的左向启动子) T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 ?（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 ? （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。 ?（4）lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子