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第五章 亲合组织化学技术 发展历史 60年代：发现生物素和卵白素 70年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌A蛋白------BRAB、LAB、SPA-HRP、ABC… 亲和组织化学：1976年Bayer首次提出 包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌A蛋白与IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等 植物凝集素(Lectin) 生物素(Biotin) 葡萄球菌A蛋白(SPA) SPA—HRP法、ABC法和LAB法等。 一、抗生物素—生物素免疫细胞化学技术 (一) 基本原理 亲合素（抗生物素/卵白素） 是鸡蛋白中含有的一种碱性蛋白，属于糖蛋白;具有4个同维生素H (生物素)亲合力极高的结合点。 链酶亲合素 是一种从链酶菌培养物中提取的蛋白质，和亲合素一样，也有四个生物素结合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。 （二）几种亲合素—生物素染色技术 1 亲合素一生物素—过氧化物酶复合物技术(ABC) 2．链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法) 3．标记生物素—抗生物素技术(LAB) 4.SP/SAP法 5.Envision法 6.CSA法 ⑴ 基本原理 是将亲合素作为“桥”与生物素化的抗体与生物素结合的酶（HRP)连接起来。 第一抗体：为未标记特异性抗体，能结合组织中待测抗原； 第二抗体：为生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合； 第三抗体：是结合了过氧化物酶的亲合素复合物(即ABC) 。 ⑵ 操作步骤 ① 冰冻切片或石蜡切片均可。 ② 冰冻切片：丙酮固定，PBS 洗5min，更换3次。 石蜡切片：脱蜡，系列酒精至水。 ③ 第一抗体孵育，过夜。 ④ PBS洗5min，更换3次。 ⑤ 加生物素标记的第二抗体，孵育15min。 (4) 注意事项 ①消除内源性生物素：染色前以0.01％的亲合素和0.01％生物素溶液分别作用20min以消除内源性生物素活性，每次作用后用PBS漂洗3次，5min。 ②消除内源性过氧化物酶：可用3％ H2O2孵育5-10分钟以灭活内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗3次。 ③试剂的保存：温度以4℃为佳，可达2年之久，在－20℃时其生物活性反而在短期内被破坏。 此外，生物素制剂之间相互亲和性差异大，注意厂家和批号。 2 链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法) 操作程序 1）载玻片防脱处理：可选择APES或Poly—Lysine，烤片。 2）切片常规脱蜡至水。 3）3％H202 灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。 4）抗原热修复：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5—10分钟后，反复1—2次。冷却后PBS洗涤。 7）滴加生物素化二抗，20—37℃20分钟。PBS(pH7.2—7.6)洗2分钟×3次。 8）滴加试剂SABC，20—37℃20分钟。PBS(pH7.2—7.6)洗5分钟×4次。 9）DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5一30分钟之间。蒸馏水洗涤。 10）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。 结果 棕褐色为阳性结果，而细胞核染为淡蓝色。 注意事项 1）染色背景过高： 在SABC反应之后，DAB显色之前，用加有0.0l一0.02％TWEEN20的PBS(pH7.2—7.6)洗涤切片4次，单纯PBS洗2次，然后DAB显色。 2）抗原热修复：可选0.01M枸橼酸盐缓冲液； 也可以使用PBS、TBS等多种缓冲液。 3 标记生物素—抗生物素技术(LAB) 原理： 第—抗体：生物素标记； 第二抗体：酶标记抗生物素(亲合素) 操作步骤： ⑴ 切片中加入生物素标记一抗，室温孵育1 h，。 ⑵ 0.01MPBS洗3次，每次5 min。 ⑶ 20-50ug／ml HRP-抗生物素液孵育。0.01M PBS漂洗3次。 ⑷ DAB显色。蒸馏水漂洗。 ⑸ 苏木精复染核。梯度乙醇脱水、透明、封片、镜检。 应用不如ABC普遍，但手续较简便，但灵敏度低。 SP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色） 三步法（以SP试剂盒为例）　　? 石蜡切片脱蜡至水。　　? 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。　　? 3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。　　? 5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血