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分子生物学 第六章分子生物学基本研究法（下）基因功能研究技术 图6-15 酵母单杂交的基本原理示意图 图6-16 从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。 6. 3. 2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。 BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 图6-17 酵母双杂交技术原理示意图 6. 3. 3 体外蛋白质相互作用技术 1、Far Western印迹技术 用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。 图6-18 Far Western印迹试验 2、GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 图6-19 GST融合蛋白沉降技术流程 3、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。 4、等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。 图6-21 等离子表面共振技术示意图 5、免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 免疫共沉淀示意图 6. 3. 4 细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件： （1）给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； （2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）； （3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 图6-23 荧光共振能量转移法 FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。常用的探针有：荧光蛋白传统有机染料镧系染料 * 6. 1 基因表达研究技术 6. 1. 1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达 模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。 图6-1 常规SAGE方法（short SAGE）基本流程 LongSAGE技术 标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。 6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可分为：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。 图6-2 选择性剪切的不同类型 a 平衡剪接 b 5’选择性剪接 c 3’选择性剪接 d 外显子遗漏性剪接 e 相互排斥性剪接 图6-3 RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切 图6-4 果蝇（Drosophila melanogaster）的Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体 6. 1. 3 原位杂交技术 原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。 RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达