天津大学生物化学课件Lecture08Enzymes.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 诱导契合模型(1) 诱导契合模型(2) 使酶具有高度催化效率的因素 邻近定向效应--不仅指底物和酶活性部位的邻近，还包括正确的立体化学排列 “张力”和“形变”--就是酶与底物诱导契合的过程 酸碱催化--酶活性部位上某些基团可用作酸碱 共价催化--与底物形成不稳定的共价中间物 影响酶促反应速度的因素 pH对酶的影响 温度对酶作用的影响 激活剂对酶作用的影响 酶动力学-米氏方程式 抑制剂对酶作用的影响 酶的别构效应 pH对酶的影响 每一种酶只能在一定范围的pH内才有活性，超出这个范围酶就失活，在某一特定pH可能表现出最大的活性 pH对酶的影响主要表现在两方面：1）强酸或强碱本身使酶变性失活；2）pH改变影响酶活性部位上有关基团的解离，或影响底物的解离 一般酶的最适pH在4-8之间 温度对酶作用的影响 在一定温度范围内（0~40°C），酶促反应速度随温度升高而加快 决大多数酶在60°C以上即失去活性 各种酶在一定条件下都有其一定的最适温度，例如动物体内酶在37~50°C 激活剂对酶作用的影响 能提高酶活力的物质就是酶的激活剂 许多酶的激活剂就是一些金属离子或其他无机离子 以巯基为活性基团的酶，易被氧化降低活性，需加还原剂（如抗坏血酸等） 酶动力学 米氏方程式 ν—酶促反应速度 [S]—底物浓度 Vmax—最大酶促速度 Km—米氏常数, Km = (k2 + k3)/k1 Km [S], ν= V/Km[S], 一级反应 [S] Km, ν= V, 零级反应 底物浓度对酶促反应速度作图 某些酶的米氏常数 酶 底物 Km (mol/L) 过氧化氢酶 β-半乳糖苷酶 麦芽糖酶 谷氨酸脱氢酶 己糖激酶 琥珀酸脱氢酶 乳酸脱氢酶 尿素酶 α-淀粉酶 蔗糖酶 H2O2 乳糖 麦芽糖 α-酮戊二糖 葡萄糖 果糖 琥珀酸盐 丙酮酸 尿素 淀粉 蔗糖 2.5 x 10-2 4 x 10-3 2.1 x 10-1 2 x 10-3 1.5 x 10-4 1.5 x 10-3 5 x 10-7 3.5 x 10-5 2.5 x 10-2 6 x 10-4 2.8 x 10-2 Lineweaver-Burk作图法 Eadie-Hofstee Plot 抑制剂对酶作用的影响 不可逆抑制作用—抑制剂与酶的结合是一不可逆反应 可逆抑制作用：1）竞争性抑制—抑制剂和底物竞争与酶结合；2）非竞争性抑制—抑制剂和底物同时结合在酶的不同部位上 不可逆抑制作用 可逆抑制-竞争性抑制 特点：改变Km不改变Ｖmax，当底物浓度很高时， 抑制作用可以被解除 竞争性抑制Lineweaver-Burk图 可逆抑制-非竞争性抑制动力学方程 特点：影响Ｖmax而不改变Ｋm，不能用增大［Ｓ］ 的办法克服。 可逆抑制-非竞争性抑制动力学图 酶活力 是指酶催化指定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下酶促反应的速率来表示， 反应速率愈快，就表明酶活力愈高，通常是测定单位时间产物的增加量来确定 国际酶活力单位（IU，1 IU = 1 μmol/min ）：在最适条件下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物所需的酶量 酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。 测定酶活力 常用分光光度法，利用底物、产物或指示剂在紫外光或可见光部分吸光度的不同，选择一个适当的波长，连续地测出反应过程中反应体系吸光度的变化，再进一步推算底物或产物浓度或数量的变化，从而求出酶活力 酶的分离纯化 原材料处理与蛋白提取：即从动物、植物、微生物等组织或细胞中提取含有目标酶的原液 粗制分离：用盐析法、等电点沉淀法或有机溶剂分离法等除去含量比较多的杂质，并浓缩酶溶液 精制分离：用柱层析法、梯度离心法或者电泳法进一步纯化 酶制剂的脱盐、浓缩、干燥和保存：用透析法脱盐，浓度较低时，需进一步浓缩或者通过冷冻真空干燥做成固体制剂进保存 酶的分离纯化应注意事项 在酶的分离纯化过程中始终保持低温（通常4 °C左右），透析、层析或电泳等操作需在专门的冷室进行 将酶在低温下保存，一般可在-20 °C至-80 °C之间保存酶制剂 使用温和的操作条件，在纯化过程中使用最适pH或接近该值的缓冲液，一般情况下不使用强酸或强碱等蛋白质变性剂处理酶样品 使用一些保护试剂，如用巯基试剂防止酶的氧化失活等 在保证纯化质量的前提下，尽量缩短纯化酶所需要的时间，并随时监测酶的活性的变化 酶工程—化学酶工程 化学修饰—将酶分子通过人工方法与一些小分子化学基团或具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质，创造出一些天然酶所不具有的优良性能 固定化酶—通过吸附、耦联