定量组织化学和组织化学的应用.pptVIP

定量组织化学 掌握内容 常用的定量细胞化学技术种类 图像分析系统、显微分光光度技术、流式细胞仪技术和激光扫描共聚焦技术在定量组织化学中的应用 概 述 组织化学的建立，开始只能对组织细胞内的化学成分进行定性、定位观察。 大量的组织细胞图像，限于人眼分辨率和定性描述的局限性，只能用文字定性的、半定量的或数据或曲线来部分地描述有关信息。 概 述 多学科技术的综合应用，如计算机、红外线、超声波、放射性核素、光纤、电视、光学和电子显微镜、磁共振、激光等，使组织化学研究上升到定量分析分子和离子的水平。 常用的定量组化手段 1、目测术——半定量技术 2、图象分析仪：测量细胞的几何参数、灰度参数、色度参数、纹理参数和细胞化学反应的光密度参数等。形态立体学技术测量计算细胞的三维形态参数。（细胞形态计量学技术） 常用的定量组化手段 3、光度测量技术定量测定细胞内物质的含量（显微分光光度技术、显微荧光技术、流式细胞仪技术等） 4、X射线微区分析测定细胞内元素或细胞化学反应产物的元素类型和含量。 5、用特殊显微镜检术进行细胞形态、细胞内成分定量测定（显微偏光技术、显微干涉技术、激光扫描共聚焦技术） 一、目测定量术 细胞计数 酶组化、免疫组化及荧光组化的初步定量描述法——阳性率和阳性强度法 共五级描述，从“－”到“＋＋＋＋” 二、图像分析系统 采用计算机技术和数学形态学方法客观精确地用数据表达细胞图象中的各种信息 按采用的计算机不同，可分为大型、中型、小型图像分析仪，医学图象处理大都采用后者。按显示的图象不同又可分为黑白、伪彩色和真彩色图像分析仪。 基本原理 把光学图像成像于摄像管的靶面上，再把摄像管的靶面上的光学图像变换成电荷浓淡表示的图像 光学信号——电子信号——模拟成像 在显微图像中的细胞或细胞器，一般具有图像的三个要素： ①浓度信息 ②位置信息 ③色彩信息 浓度信息作为图像中重要的一种信息，度量它的尺度称为灰度，它代表图像各部分颜色的深强程度。 灰度共有256级 ，0为黑色，255为白色 人眼判断图象浓淡时，灰度分辨率大约在20灰度级以下 位置信息是指在一幅图象平面上建立坐标系，用X和Y表示图象中任一象素点的二维平面位置 而函数形式f(x,y)表示位置为(x，y)那一像素点上的灰度。 人眼对彩色的分辨能力大大高于对黑白图象灰度级的观察。 因此，在图像分析中．常常使用不同的彩色和色调的变化来代替图像黑白灰度级别的变化、以达到突出图像信息空间分布的目的。 真彩色和假彩色 红光R、蓝光B、绿光G Y＝x R + y B + z G (x,y,z分别表示每种光的主观亮度) 图像分析系统测定的主要内容 1、形态学参数测定：对细胞、细胞核、细胞器大小、轮廓的定量描述——周长、直径、面积、轴比、圆球度、核质比等。 如：肿瘤细胞核与正常细胞核的大小，前者比后者显著增高 图像分析系统测定的主要内容 2、灰度参数： 细胞质、细胞核、平均灰度、最大灰度、最小灰度、灰度范围、灰度变化系数等 3、光密度测量 带有光密度计组件，测定被测物的光密度 是一种绝对值，与图像颜色的深浅有关。 图像分析系统测定的主要内容 4、色度参数： 5、细胞染色体核型的自动分析 三、细胞光度测量 主要定量测定通过细胞化学反应后的最终反应产物的量，并以标准物作对照，得出定量结果。 细胞光度测量从原理上可以诸多光学现象的任何一种作为基础，如吸收、发光(荧光、磷光)、阻滞(干涉、偏振)、反射(镜面、散射)等。最常用的方法是吸收光度测量、荧光光度测量、干涉测量和反射测量等 吸光光度测量和显微分光光度计 细胞吸收光度测量，取决于有色的或不透光的化学基团从特定波长光线接受能量的能力。 吸收物质或嗜色体，可以是细胞内产生的（如核酸），也可以是细胞化学反应的产物，或染料染色的结果。 显微分光光度计 又称细胞分光光度计 主要结构 1、光源：白炽灯（400-700nm）卤钨灯（320-300nm）、氙灯（180-1000nm）、汞灯（一般用于激发荧光）等 2、分光系统：色散元件、滤光片、棱镜、光栅单色仪等，目的是使进入显微镜的光波亮度充足，波长单一且可调。 主要结构 3、显微系统： 4、自动聚焦系统 5、扫描系统：针对X、Y轴 6、光电接受系统 7、电子控制系统及计算机：控制样品测量条件和数据分析。 样品要求 1、避免使用含高光密度物质的固定液 2、细胞尽量分散，单个测量 3、选择合适的染色方法，不能双染。 应用 1、DNA含量测定 2、蛋白质含量测定 3、酶含量测定 4、光密度显微测定 流式细胞仪（FCM） 它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进