第8章第1节基因诊断3,lmj.pptVIP

PICS?Altra?II流式细胞仪(分析分选) * * * (七)DNA序列测定 该法是基因诊断所有的技术方法中最准确最可靠的—种。缺点：费时、费力、费用高。 * * 二、基因诊断的主要技术方法 * (一)点突变的检测 三、常见的基因异常及其检测 (二)大片段核苷酸丢失或插入的检测 (三)基因重排的检测 (四)基因扩增的检测 (五)DNA多态性的检测 (六)基因表达异常的检测 (七)病原体基因的检测 * * * (一)点突变的检测 狭义的点突变指碱基替代，分为单点突变和多点突变；广义的点突变还包括少数核苷酸的缺失或插入。 1.已知点突变的检测 突变位点已被阐明的遗传病，可采用PCR等位基因特异性寡核苷酸杂交(PCR/AS0H)检测。 * * 三、常见的基因异常及其检测 * PCR/AS0H 检测: (1)根据突变点上下游的序列设计合成引物，PCR 扩增出突变区的DNA片段。 (2) 将PCR产物用斑点或狭缝点样器点在尼龙膜上，以紫外线照射固定。 (3) 针对上述每种突变位点，分别合成 2个寡核苷酸探针；其中一个具有正常的碱基序列，另一个则具有突变的碱基序列。 (4)分别预杂交、杂交、洗膜、放射自显影或显色。 (5) 分析正常探针及突变探针分别杂交得到的显影或显色图谱，即可作出基因诊断 * * N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因 ASO1 ASO2 N H M (PCR/AS0H 检测示意图) * * 2.未知点突变的检测 初筛：PCR-SSCP分析法 确认：DNA sequencing。 * * PCR-SSCP: 广泛用于大批样品基因突变的检测(初筛)。 * * 3. 少数核苷酸缺失或插入的检测 可供选择的方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR、PCR-SSCP及DNA测序等 * 镰形细胞贫血 原因：β-珠蛋白链第 6位密码子GAG→GTG，造 成Glu→Val所致。 方法：设计一对引物PCR扩增可得294bp，Oxa NI 消化，电泳。 294 191 103 bp A A：正常人 B B：纯合子病人 C C：杂合子病人 结果： * * * (二) 大片段核苷酸丢失或插入的检测 1. 中等长度 (0.5-1.5kb) 的DNA片段缺失或插入，可用一对引物的普通PCR检测。 * 2. 若基因较大度 (大于1.5kb) ，且多个位点 存在插入或缺失、位点间距离较远，宜采用多重PCR法检测。 5’ 3’ 3’ 5’ （多重PCR的引物设计示意图） 三、常见的基因异常及其检测 * DMD基因定位于人类 X染色体短臂 Xp21.2上。位于该区的dystrophin(肌营养不良蛋白)基因的突变或部分缺失，是导致DMD的原发病因。 dystrophin基因中有9个易发生缺失的热点区片段,它们分别位于外显子4、8、12、17、19、44、45、48和51。 杜氏肌营养不良症 (Duchenne muscular dystrophy, DMD) * * 多重PCR法检测中的基因突变 同时用2对引物双重扩增dystrophin基因外显子17和48区域内的2个片段，可检测出75％左右的基因缺失型患者； 若同时用9对引物多重扩增，则可以检测到90％左右的基因缺失型患者。 * * (三) 基因重排的检测 基因从一条染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置称基因易位或重排。 1.荧光原位杂交技术(FISH) 。 2.PCR扩增 可用不同颜色的荧光标记DNA探针，可在染色体上定位基因或DNA片段及它们彼此间的排序。 前提条件是已知重排基因和位点的序列。 * 三、常见的基因异常及其检测 荧光原位杂交（双色FISH） * * * (四) 基因扩增的检测 基因扩增指基因拷贝数增加的现象,可增加几十到上千倍。 可用待测基因的 DNA片段或cDNA片段为探针，基因组DNA 采用适当的限制酶酶切后作Southern印迹杂交分析。 * 三、常见的基因异常及其检测 * (五)DNA多态性的检测 1.限制性片段长度多态性(RFLP) 2.数目