第4章基因工程的主要技术及其原理.pptVIP

三 Northern杂交 总RNA或mRNA→甲醛变性琼脂糖电泳→印迹转膜→预杂交→杂交（变性探针） →洗膜→放射自显影或显色 四 菌落或噬菌斑杂交 菌落原位杂交示意图 五 Western杂交 PVDF膜 目的蛋白质 抗目的蛋白的第一抗体 羊抗家兔IgG的第二抗体 偶联的碱性磷酸酶 磷酸化生色体系 显色 第四节 聚合酶链式反应技术 一 PCR技术原理 PCR( Polymerase Chain Reaction):一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应。 DNA的体外复制 高温变性: 92-96℃ 低温退火: 37-72℃ 适温延伸: 72℃ （一） PCR技术的基本过程 5’ 3’ 3’ 5’ 变性、退火、延伸 循环n次 一 次 循 环 两 次 循 环 变性 5’ 3’ 3’ 5’ 退火 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 延伸 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ n次循环后双链DNA在 理论上的最高值为2n （二） 平台期与平台效应 平台效应形成与下列因素有关： 平台效应：PCR 反应经过一定数量的循环后，随着产物的指数积累趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进人线性增长或静止期。 （1）引物、dNTP快速掺入底物中，其浓度降低，掺入速度减慢； （2）随产物增加，酶与模板的比例下降； （3）非特异性产物或引物二聚体与反应物竞争； （4）产物的再结合。 PCR产物的积累规律示意图 二 PCR反应体系 PCR反应需用一定的条件才能完成，这些条件主要指： 10?缓冲液（Mg2+） DNA模板 dNTP(dATP,dTTP,dGTP,dCTP) 一对引物 DNA聚合酶(Taq酶） 无菌水（补足体系用） （一）TaqDNA聚合酶 以单链DNA为模板，以引物为起点，按5’?3’方向合成新生互补链 无3’?5’外切酶活性 耐高温（95 ?C） 最适合成DNA温度为72 ?C （二）引物 引物长度(16-30bp) 退火 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 变性 5’ 3’ 3’ 5’ 防止一对引物内及引物之间同源性，避免形成引物的发卡结构或“二聚体” GC含量为40%-60%，两引物的Tm值相近， Tm = 2（A+T）+ 4（G+C） 引物3’端不能进行修饰或形成二级结构； 引物的5’端可进行修饰，如添加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等 引入突变位点、插入或缺失突变序列等。 （三）PCR反应的最佳条件 Taq DNA聚合酶的浓度为1.0-2.5U/100uL反应液； dNTP的浓度为20-200umol/L; Mg2+浓度为0.5-2.5mmol/L； 引物浓度为0.2-1.0umol/L。 三 PCR技术的应用 （一） 反转录PCR * * 第四章 基因工程的主要技术及其原理 第一节 DNA和RNA的提取与纯化 一 DNA提取的基本原理与方法 （一）DNA提取的基本原理 DNA的性质： DNA是极性化合物，不溶于有机溶剂，溶于水，在水中溶解度达10g/L，其钠盐比游离态更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA与核蛋白复合体DNP在在低盐浓度（0.1mol/L NaCl）溶液中溶解度最低（为水中的1%），在高盐浓度（1mol/L NaCl）溶液中溶解度较高（为水中的2倍），而核糖核蛋白RNP受盐浓度影响较小，在低盐浓度中溶解度仍较大。从而可将DNP和RNP分开。 提取和纯化DNA，首先需破碎或溶解细胞，用高盐（1mol/L NaCl）将DNP抽提出来，再把蛋白质、多糖、RNA及无机离子除去。 (1). 细胞裂解和DNA的溶解； 一般采用机械破碎或酶解细胞释放DNA，严防细胞中各种酶对DNA的 破坏： 1)利用液氮在超低温下研磨，使酶失活； 2)快速加入缓冲液并迅速混匀，保护DNA。 DNA提取的步骤： EDTA：螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+，降低DNA酶活性； SDS：变性并降解蛋白质，降低DNA酶活性； 抗氧化剂：PVP，β-巯基乙醇，抗坏血酸、半胱氨酸，DTT降低酚类氧化 对DNA的干扰 PVP：有效去除酚类和多糖物质。 (2). 与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除； 主要利用DNA与蛋白、多糖性质不同，加入离子变性剂、去污剂使其变性解聚； CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵，可溶解细胞膜，，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl） 与DNA结合形成复合物并呈溶解状态，但当浓度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，DNA即从溶液中沉淀，通过离心可将DNA-CTAB复合物与