第2章新基因工程及其在食品工业中的应用.pptVIP

小结 cDNA合成过程 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 3.基因与载体的连接 限制酶剪切或机械剪切目的基因或载体可以产生粘端和平端的DNA分子。催化二者重组连接（粘端或平端）反应的酶常用T4DNA ligase。 （一）粘性末端连接 用同一种酶分别切割目的基因/载体，然后进行连接。 优点：二者产生相同的粘性末端，彼此很易按碱基配对退火，在ligase作用下生成DNA分子重组体。 （二）平端连接 没有合适的产生粘端的限制酶切位点，可采用平端连接，但连接效率粘端。并且连接反应中更偏向于载体自身环化，拟用下述措施可提高连接效率。措施： （1）大大增加ligase量，有人估算是粘端同等条件的100倍。 （2）增加目的基因DNA分子量，增加与载体碰撞的机会。 （3）BIP或CIP去除载体两端5’—P基团，防止环化。 （三）同聚物加尾连接 末端转移酶可催化DNA 3’末端添加单核苷酸的反应，形成寡聚核苷酸尾巴，链的长短可通过反应条件加以控制，末端转移酶不具有特异性，在4种dNTP中任何一种均可作为前体物，可以产生由单一核苷酸所构成的3’同聚物末端。如外源DNA末端添加寡聚T，载体DNA末端添加与T互补的寡聚A，两者形成互补黏性末端便可连接起来。 目的基因的检测和鉴定 多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。 质粒 目的基因 限制酶切割 一个切口 两个黏性末端 两个切口 目的基因 DNA连接酶 表达载体 同一种 1. 目的基因与运载体结合所需的条件有 ①同一种限制酶 ②具有抗性基因的质粒 ③RNA聚合酶 ④目的基因 ⑤DNA连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸 ⑦ATP A．①②③④⑤⑥⑦ B．①②④⑤⑥⑦ C．①②③④⑤ D．①②④⑤⑦ D 2.基因表达载体的组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因 位于基因的首端, RNA聚合酶识别和结合位点，转录起点 位于基因的末端,终止转录 检测目的基因是否导入受体细胞和筛选含目的基因的细胞 它们有什么作用？ 编码蛋白质的结构基因 复制原点 复制的起点 ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体和目的基因，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必须以表达载体的方式携带进去。 注意 （四）人工接头连接 人工接头:人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列，将其接在目的基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点，应用相应的内切酶切割，就可以分别得到互补的黏性末端。 常用的受体细胞： 大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等 三、将目的基因导入受体细胞 方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——感受态细胞 1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法 特点: 能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色体DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 （2）基因枪法（单子叶植物常用） 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 手提式基因枪 （3）花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，在花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 过程: 含目的基因 表达载体 受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： 大肠杆菌细胞 用Ca2+