第10章基因转移到动物细胞.pptVIP

原生质体融合法 质粒（目的基因）转化细胞，大量扩增，用溶菌酶或蜗牛酶除去胞壁部分，在高盐条件下，制成原生质体，然后铺到培养的单层哺乳动物细胞上，在融合剂的作用下，经融合过程，使染色体和质粒DNA转入哺乳动物细胞。 优点：转化效率高，基因片段大，既可用于克隆化基因的瞬时表达，也可用于建立稳定转化的哺乳动物细胞系 缺点：操作较繁，细菌或酵母碎片影响细胞生长。 上述方法中，基因转移效率相对偏低，表达水平也不高。不能满足真核细胞基因转移，尤其是以基因治疗为目的的基因转移。因此，在80年代后期引入了动物病毒载体技术，转染效率几乎可达到100% Package the DNA inside an animal virus 三、 基因转移的生物学方法 Naked DNA Target Cell Protein expression AAV Retrovirus/Lentivirus Adenovirus Nucleus Animal Gene Delivery Principles Functional changes Advantages Easy to produce transgene particle Non-immunogenic Disadvantages Inefficient cell entry Transient transgene expression Inefficient nuclear entry Non-Viral Methods of Transgene Delivery 优点： 1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。 存在的问题： 细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性 转导靶向性 转录靶向性 转导效率 靶向性 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性 1、安全性 2、靶向性 3、有效性 Adeno-associated virus (AAV) Advantages: Highly efficient transduction for both replicating and non-replicating cells Infect almost only neuron in brain Good long term expression Normally no human pathogenicity Disadvantages: Only 5% integration—diluted when cells divide Complicated purification process Advantages: Highly efficient transduction of replicating and non-replicating cells. Good for neurons CAR receptor present on many cell types High titer production readily achievable Normally - minimal human pathogenicity Adenovirus Disadvantages: No integration—diluted when cells divide 逆转录病毒载体 逆转录病毒是一类含RNA的病毒，进入受体细胞后，RNA反转录成DNA，通过两端由数百bp组成的长末端重复序列，整合到染色体上，成为原病毒。 只要将外源目的基因组入原病毒DNA的合适克隆位点，就能在感染的动物细胞中表达。 Advantages: Highly efficient transduction of replicating cells ( Highly efficient transduction of non-replicating cells (FIV, HIV…). Good for neurons Integrate into genome of target cells for long-term expression in dividing cells. Easy to produce High titer production readily achievable Retrovirus Disadvantages: Possible human pathogenicity Retrovirus 目前常用的逆转录病毒载体是经过改造的Moliney鼠白血病病毒（MoMLV）。 基因结构分子两端含长末端重复序列（其中含启动、增强