第二章微生物生态学研究方法.pptVIP

第二章、微生物生态学研究的基本方法 一、微生物生态学研究的传统方法 直接测定（代表性）：光学/电子显微镜，计数器 培养方法：平板菌落计数法、最大或然值法 土壤、污泥：深度范围 水体：直接采集、过滤浓缩 空气：无菌下滤纸过滤 生物体：无菌溶液洗涤保存、分析 最大或然值法（most possible number,MPN法，稀释法）：将样品用无菌生理盐水进行系列稀释，取一定稀释度的稀释液接种于培养基中，培养一定时间，观察各种稀释度的生长情况。据生长管数统计微生物数量。用于好氧/厌氧异样菌总量，硝化反硝化菌总量、硫酸盐还原菌总量等的测定。 代谢活力的测定（同位素标记、酶活力、ATP、叶绿素、呼吸作用和光合作用） 数学方法（人工模拟实验）  微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容。 20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。 3、生物标记物法（Biomakers ） 生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。 特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。 首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适的仪器加以定量测定。 磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。 4. ERIC (肠杆菌基因间保守重复序列) -PCR指纹图谱技术 Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。 5. 以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法 实验原理 16S rDNA是基因组的“biomarker” – 核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16S rDNA广泛存在于所有原核生物的基因组中。 – 16S rDNA的序列中包括保守区和可变区。 – 序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应，而且一般不发生水平转移。 – GeneBank和RDPⅡ（Ribosomal DatabaseProject ）数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释的16S rDNA序列，可供进行比对。 环境16S rDNA文库的构建与组成分析技术 1990年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性。 16S rDNA文库中的蓝藻种类与培养出来的蓝藻很不一致； 发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群； 与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生物多样性； 这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。 构建环境16S rDNA文库的方法 用环境基因组总DNA进行16S rDNA PCR扩增：把环境中几乎所有微生物基因组上的16S rDNA扩增并收集到一起。 universal primers: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ (E.coli bases 1507 to 1492) “TA克隆”：把每一个16S rDNA分子放到文库中的每一个克隆里。 ARDRA分型与测序 克隆文库的统计分析 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。 Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。 此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 。 原理 双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。 不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。 然而，当变性剂浓度达到D