基于测序技术的基因研究策略分析2011-5yubao.ppt

基于测序技术的基因研究策略 陈 禹 保 博士 allexchen@126.com 北京标凯科技有限公司 引 言 基因，遗传物质和遗传信息的载体 基因，是所有生命共同的密码的所在，是生命的本源 为了解读生命生、老、病、死的密码，就必须解析基因、研究基因，应用基因为人类生存、健康造福 如何研究基因？ 基因是如何发挥作用的？ 用什么工具研究基因？？ 基因组(genome) 一个生物体的全部基因 和染色体组成携带的全部遗传信息 通过测序方法对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）， 核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学 转录组学从基因组DNA转录的基因总和，即转录组，也称表达谱，研究生物细胞中转录组的发生和变化规律的科学就称为转录组学 蛋白质组学 在整体水平上研究细胞内蛋白质组分及其活动规律的新学科就称为蛋白质组学 表观基因组学 基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,如DNA甲基化和染色质构象变化等分析称表观遗传学，在基因组水平上对表观遗传学改变的研究称表观基因组学 生物信息学 （Bioinformatics） 1、生物分子数据的收集与管理 2、数据库搜索及序列比较 3、基因组序列分析 4、基因表达数据的分析与处理 5、蛋白质结构与功能预测 6、基因-蛋白相互作用网络 7、整个系统调控网络 问题和背景 1、在农林渔牧等行业，研究者常各自研究不同的非模式生物，缺乏商业化检测工具；在医学中，特别是感染性疾病，由于病原体多种多样，往往没有现成基因序列检测工具。 2、大部分非模式生物基本缺乏基因组序列信息，利用传统测序成本很高。 3、大部分生物缺泛表达序列信息。 4、蛋白质组学研究需要基因组序列信息。 5、传统研究往往是通过构建cDNA文库然后测序以获得序列信息，但成本很高。 6、解决方案：通过高通量测序技术，获得序列信息；然后采用原位合成技术定制芯片，进而用芯片检测研究生物学问题。 获取基因组信息：测序 vs.芯片 基因序列信息的从头获得依赖测序技术：测序技术是开放系统，特别适合于获得一个物种新的基因信息，例如人类基因组计划，以及新增加的多个物种的基因组信息，都是通过测序获得的。第二代测序技术更极大地增强了测序的发现能力。但目前全基因组或全表达组测序成本很高。 芯片技术最适合对已有序列信息后的检测：芯片技术是封闭系统，通常需要在序列已知的前提下设计芯片，多用于检测已知序列的不同状态下的变化。芯片技术特别适合于检测已知基因序列的信息，包括CGH，SNP，mRNA表达等。基于核酸杂交，芯片检测具有快速、准确和低成本优势 测序技术 传统Sanger测序法以其可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是测序速度慢。用于人类基因组计划用时达13年，远不能适合高通量需求。 第二代测序技术，也称之为新一代测序技术(next-generation sequencing)，深度测序技术(deep sequencing)。其核心是DNA片段的单分子分离、扩增和测序，因其不需要克隆制备，具有通量高，数据获取能力强的优势。 基因芯片技术 通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。 测序 vs.芯片 第一代测序技术 要得到核酸分子片段的序列，需要至少考虑2个基本问题，1是得到单一序列片段；2是基于某种原理的测序检测过程。测序技术的不断进步都是对这2个基本问题的更好解决。 传统Sanger测序技术，在解决单一序列获得的问题上，是把DNA片段连入质粒载体，转化细菌并扩增，得到大量质粒克隆形式的均一序列。测序采用ddNTP使DNA聚合酶合成链终止，然后进行测序胶电泳判断，或4种荧光标记ddNTP进行毛细管电泳读取序列。 传统Sanger测序法以其可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是测序速度慢。用于人类基因组计划用时达13年，远不能适合高通量需求。 测序通量低也是由这2个基本问题决定的，要构建质粒，挑单克隆，测序判读时要分别电泳。这些都限制了通量提高，即使是“鸟枪法”测序(随机得到大量的质粒克隆而不去事先筛选，采用更多数目的毛细管电泳这2个方面改善)，也要受限于这些基本障碍。但随“鸟枪法”测序得到发展的序列拼接技术为第二代测序奠定了一定基础。 传统Sanger法特点与应用 关键词：双脱氧终止法，毛细管电泳 适于：Kb-Mb的项目 缺点： 低通量，高成本，费时，步骤繁琐 克隆偏向性，无法测低丰度表达的基因 对重复序列测序存在困难 基因组测序需要样品量高