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主要内容 1、基因工程原理 ● 理论上的三大发现 （1）20世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA （2）20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机理 （3）20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式 ● 技术上的三大发明 （1）限制性核酸内切酶和DNA连接酶 （2）基因工程的载体 （3）逆转录酶的发现 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶 Ⅱ型酶（用途最广） 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 特点： 1. 在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂; 2. 两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的; 3. 因此，断裂形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。 限制酶（Ⅱ型） 特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断 回文序列：是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称; 限制酶切出的末端 粘性末端（sticky end）:两条链上的断裂位置是交错的、但又是围绕着一个轴线对称排列，其结果产生两个互补的单链末端，这种单链末端由于可以互补成双两结构，所以称为粘性末端。 平末端（blunt end）: 在识别序列内同一位置上的核苷酸处进行切割，产生的DNA片段不带粘性末端而是没有单链突出的平齐末端。 DNA连接酶(DNA ligase) DNA连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ-OH与另一条链的5ˊ-PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。 DNA连接酶的用途 （1） 两个双链DNA片段连接起来 5ˊ- ACG AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶 5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ 3ˊ- TGCTTAA GCA-5ˊ T4DNA连接酶 3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ （2） 修补带有缺口的双链DNA分子 限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子的操作过程 大多数的DNA片段不具备自我复制能力，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，就必须将DNA片段连接到一种具有自我复制能力的DNA分子上，这种DNA 分子就是载体。 载 体（Vector） 载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具，其化学本质为DNA 。 常用的载体分为3类：质粒、噬菌体和病毒  逆转录酶（reverse transcriptase） 特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性 ⑴ 以单链RNA 为模板， 催化合成cDNA单链 ⑵ 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA ⑶ 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。 逆转录酶的应用： ⑴ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； ⑵ 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段； ⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析； ⑷ 制备杂交探针等。 1972年，美国斯坦福大学Berg博士领导的一个研究小组，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，基因工程从此诞生。 基因工程的基本内容 基因工程：又称为重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在微观领域(分子水平)中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。又称为基因克隆（gene cloning）或分子克隆（molecular cloning）。 克隆（ cloning ）：指无性繁殖系，即由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。 基因工程的主要步骤 1. 从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段------目的基因的获得。 2. 将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子------ DNA分子重组。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞内------导入。 4. 筛选获得了重组DNA分子的受体细胞进行克隆----分子克隆。 5. 克隆基因的表达，产生出人类所需要的物质----基因表达。 1. 目的基因的获得