基因工程-6-重组dna构建与筛选.pptVIP

第二节 重组DNA分子构建 一、粘末端DNA片段的连接 二、平末端DNA片段的连接 （一）直接用T4连接酶连接 （二）同聚物加尾法 （三）衔接物连接法 （五） PCR引入酶切位点 （六） cDNA与载体的连接 第三节 基因转移 一、重组DNA导入大肠杆菌 （二）转染 （2）λ噬菌体的体外包装 （三）电激法(electroperation) 1.电转化流程 （1）电转化感受态细胞的制备 二、重组DNA导入植物细胞的方法 （一）载体介导的转化方法 （2）叶盘共培养法 （二）病毒介导的基因转移 （1）双链DNA病毒转化载体 （4）激光微束法(laser microbeam) （5）超声波法 （2）微注射法（micro-injection） （3）花粉管通道法（pollen-tube pathway） （2）DEAE-葡萄糖转染技术 （3）电穿孔转染技术 研究实例一 3.重组子筛选与表达 外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况： 一、重组体的筛选 遗传检测方法 抗药性标记插入失活 β-半乳糖苷酶显色反应 插入序列表型特征 免疫化学方法 免疫沉淀法 放射性抗体检测 核酸杂交方法 转译筛选法 插入失活-环丝氨酸筛选法 (三) 核酸杂交方法 二、核酸探针类型 1、双链DNA探针 ⑴ 切口平移法 2、寡核苷酸探针 3、RNA探针 非放射性标记原理 三、菌落原位杂交 1、杂交抑制转译 研究实例二 Materials and methods Cloning of full-length CDS of lasB and sequence analysis Transformation of P. pastoris with pPIC3.5K/PAE SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) The molecular mass of the recombinant enzyme was determined by using SDS–PAGE (12% polyacrylamide). A volume of 16 uL of the supernatant was added into each lane of the gel. After electrophoresis, the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250, and destained by washing with a mixture of acetic acid–methanol–water (10:25:65, v/v/v). 菌落生长 转移到NC膜上 DNA释放和变性 固定 杂交 洗膜 放射自显影 查找阳性克隆 四、斑点杂交（Dot blot） 模板制备 点膜 固定 杂交 洗膜 放射自显影 查找阳性克隆 五、转译筛选法 无细胞翻译系统 要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA 。 DNA 蛋白质 mRNA 蛋白质 × 杂交 原理： 2、杂交选择转译 第五节 重组DNA鉴定 一、克隆基因片段大小的分析 ①酸酚法 ②煮沸法 直接电泳比较 ③碱裂解 二、克隆基因的酶切图谱分析 ①单酶解分析——克隆片段的存在、大小 ②双酶解分析——定向克隆用 ③多次酶解分析——切下的小片段再酶解 ④部分酶解分析——物理图谱 三、克隆基因的顺序分析 绿脓杆菌 重组胰肽酶 毕赤酵母 Elastase, catalyzing the hydrolysis of elastin (弹性蛋白）, is a member of zinc metalloprotease family . Elastase hydrolyzes insoluble elastin much more efficiently than other protease and has been widely applied in many aspects, such as a medicine curing hyperlipidemia（高血脂） and arteriosclerosis（动脉硬化） the elastase produced by Pseudomonas aeruginosa has been studied thoroughly. P. aeruginosa is an opportunistic pathogen and can produce many toxic substances during fermentatio