分子克隆全攻略.pdfVIP

分子克隆 一、载体与外源片段（PCR 产物）的双酶切 为了保证做连接反应时有足够的量，应该加入1ug 的DNA 进行酶切反应；两种酶分别 加1ul，10*buffer 2ul，1ug 的DNA ，加水至20ul 。（因此要跑胶分析DNA 以及载体的浓度， 取1-2ul，电泳检测其含量。1ul 量太少，可以加将其稀释在9ul 水中，再加loading buffer 。 6ul 15000bp 的maker ，2500bp 条带的亮度约是100ng DNA。可对比maker 的亮度算出酶切 回收的DNA 的浓度，以便于连接反应的用量。Image J 软件可以做灰度分析。） 双酶切反应结束后，使用PCR cleanup 试剂盒回收DNA 与载体。回收完之后用同样的 方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA 的浓度，但是，一般酶切反应之后 浓度会比较小，取1ul 稀释100 倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵 敏度很高，还可一排除杂带、RNA 、蛋白质等对浓度的干扰。） 二、连接反应 载体100ng，DNA 片段根据大小，1ul buffer， 1ul T4 连接酶，加水至10ul；16°连接 12-16h。 载体 （约0.03pmol ）与外源DNA 的摩尔比大约1：3~1 ：10 之间，根据载体与DNA 片 段的长度，可算出需要的量。扫胶的电脑上有个文件：连接反应.xls，按要求填写即可得出 连接反应的用量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol 的载体的 质量意义不大，大约100ng 即可。 如果时间比较紧张，可以25 °连接15min，之后可取5ul 进行转化，剩余5ul 16°继续 连接。 三、质粒转化到感受态大肠杆菌中 从-70°中取出感受态，在手心融化后立即插入冰上，5ul 连接产物+100ul 感受态大肠杆 菌，混匀。冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP 管。然后立即插入冰上，静 置2min 。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿 失。） 在超净台中加入700ul LB 培养基，然后37°摇床培养45min-1h； 4000rpm 离心3min，在超净台中弃去700ul 上清，然后轻轻吹打残留的菌液沉淀，涂平 板；（涂平板的玻璃棒要在酒精灯上烧热灭菌，后冷却） 37°培养箱先正放15min，之后倒置培养12-16h。（超过16h，则阳性克隆周围会生出卫 星菌落，原因是阳性克隆会分泌水解氨苄的酶到培养基中，水解其周围的氨苄，因此，平板 上的DH5α、杂菌等会生长。） 四、重组子的挑取培养 挑选单克隆到2ml LA 培养基中，37°培养8-16h，可提质粒。（要在管壁上部用注射器 的针头烧热，戳个小洞，因为大肠杆菌是好氧的，无菌会生长缓慢） 其实在挑克隆培养的时候就可以PCR 鉴定，先配好PCR 反应体系，在超净台中，同一 个克隆，一半用于摇菌培养，一半用小的枪头挑取在对应的PCR 体系里涮一下，即可作为 模版进行PCR 反应。PCR 时要做阴性、阳性对照；阴性对照，用枪头在没有菌落的培养基 上沾一下做模版（PCR 灵敏度很高，要排除连接体系中的残留的DNA 对结果影响的可能）， 阳性对照用最初PCR 扩增DNA 片段时的模版。 也可以等37°培养8-16h 之后取 1ul 菌液做模版鉴定，或者提质粒之后，用质粒做模版 进行鉴定，均可。 五、质粒的提取与电泳检测 1. 在超净台中取 300ul 菌液与无菌 EP 管中，4 °保存，待鉴定是否成功后取 100ul 菌液 +100ul 50%甘油保种，送200ul 菌液到公司测序，不正确的丢掉即可。（如果质粒量很 多，也可以送5-10ul 质粒测序） 2. 取 1ml 菌液到新的EP 管, 12000 rpm 离心30s，弃上清，再将700ul 剩余菌液于同一 EP 管，12000 rpm 离心30s，弃上清。然后瞬时离心，将残留液体吸干。（枪头不能重 复使用） 3. 加入预冷的 100µl 溶液 I 。反复吹打混匀。（一定要混匀，不然会影响裂解效果，可以 用涡旋混合器震荡混匀） 4. 加入200µl 溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5 次。（不要剧烈震